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鐵蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 以質(zhì)粒為模板做pcr時(shí)要不要稀釋？已有4人參與

我新設(shè)計(jì)的引物在5端突變了幾個(gè)堿基，以前的引物以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增不出來(lái)，而以雙酶切產(chǎn)物的話就能擴(kuò)增出來(lái)，現(xiàn)在新設(shè)計(jì)的引物下游引物不變，上游引物突變了幾個(gè)堿基，以質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物為模版都擴(kuò)增不出來(lái)呢，這是為什么？是不是以質(zhì)粒為模板時(shí)一般要進(jìn)行稀釋，要比pcr雙酶切產(chǎn)物濃度低才可以？

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1樓 2014-01-10 08:55:28

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sxxuan

金蟲(chóng) (著名寫手)

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有時(shí)候懶得計(jì)算質(zhì)粒濃度，一般是50ul體系里面加入0.1～0.5ul的質(zhì)粒作為模板。這里說(shuō)的質(zhì)粒是提取出來(lái)正常的濃度，就是比marker最亮的條帶都亮很多，亮到刺眼的那種。有時(shí)候也會(huì)稀釋5～10倍后再加0.5～1ul

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3樓2014-01-10 10:09:23

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liyongliangx

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以質(zhì)粒為模板，PCR要求濃度在0.1-10ng 之間就可以了

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2樓2014-01-10 09:56:21

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lvbobo823

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質(zhì)粒需要稀釋一下，我們一般都是稀釋100-1000倍再做PCR

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hehe

4樓2014-01-10 12:18:47

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cxwu10016869

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引物5‘端堿基突變后，不能與模板配對(duì)，退火溫度應(yīng)降低。

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5樓2014-01-10 13:00:25

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