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求助酶的鎳柱純化 已有3人參與
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| 小弟最近在做酶學(xué)性質(zhì)，但一直卡在鎳柱純化這一塊，先前是蛋白掛不上去，聽(tīng)各位師兄師姐的建議調(diào)低咪挫之后，蛋白掛上去了，后來(lái)用咪挫洗，跑電泳，除目的蛋白外還有少量的雜蛋白，最近一次跑交發(fā)現(xiàn)里面雜蛋白好多，簡(jiǎn)直就是原蛋白稀釋后的，完全沒(méi)有純化出來(lái)。想請(qǐng)教師兄師姐，純化出來(lái)的只有目的蛋白的一條帶的是怎么弄得，謝謝。（小弟先前是這樣的，上樣：1mmol/l，平衡液10mmol/l，洗脫500mmol/l） |
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fuyuandj86
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-01-17 12:49:27
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我一般用的咪挫是equilibration 5mM, wash 20 mM, elution 250 mM. 我假定你說(shuō)的平衡液就是指wash buffer 你這個(gè)濃度應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，但是不僅僅是濃度，還有你一般用多少體積來(lái)。如果洗的體積過(guò)多，蛋白就都洗沒(méi)了；洗的體積太少，還有雜質(zhì)。對(duì)于10ml的鎳柱，我一般不會(huì)用超過(guò)50ml wash buffer. 實(shí)在純化不出來(lái)就用鈷柱吧，比鎳柱貴，但是特異性好很多 |
2樓2014-01-16 23:39:35
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8樓2014-01-17 15:56:34
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9樓2014-06-16 09:41:12
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