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[求助] QPCR擴(kuò)增曲線異常已有7人參與

我有對(duì)引物，普通PCR并電泳檢測(cè)，條帶很亮，大小也是我需要的，到了QPCR上，溶解曲線正常，擴(kuò)增曲線很奇怪，沒(méi)有CT值，你們遇到過(guò)嗎？什么原因啊？金幣不多啊

，懸賞有限啊

謝謝

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1樓 2014-02-19 22:09:44

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forrestgump

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1）濃度太高了；2）就沒(méi)有進(jìn)行PCR酶活性成了問(wèn)題；3）說(shuō)不清的因素。

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3樓2014-02-19 22:31:06

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jiaolong11a

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感覺(jué)你的PCR產(chǎn)物很小啊，溶解曲線不會(huì)是引物二聚體的吧

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多情總被無(wú)情擾。。。愁

6樓2014-02-20 08:35:32

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wangweijian

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你的熒光信號(hào)值好低，我做的一般都是100000以上的，應(yīng)該是探針出了問(wèn)題，換個(gè)探針試試，或者把熒光PCR產(chǎn)物跑下電泳看看有沒(méi)有產(chǎn)物，有產(chǎn)物的話肯定是探針的問(wèn)題。

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8樓2014-02-21 22:08:19

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shiyiyaya

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沒(méi)遇到類似情況。
DNA電泳能看見(jiàn)條帶，說(shuō)明有產(chǎn)物。
溶解曲線還可以，但不是很尖銳，說(shuō)明反應(yīng)孔沒(méi)有選錯(cuò)誤。

會(huì)不會(huì)有污染？或者探針失效？
有沒(méi)有正對(duì)照或負(fù)對(duì)照？結(jié)果都類似嗎？

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2樓2014-02-19 22:21:38

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2樓: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-19 22:21:38
沒(méi)遇到類似情況。
DNA電泳能看見(jiàn)條帶，說(shuō)明有產(chǎn)物。
溶解曲線還可以，但不是很尖銳，說(shuō)明反應(yīng)孔沒(méi)有選錯(cuò)誤。

會(huì)不會(huì)有污染？或者探針失效？
有沒(méi)有正對(duì)照或負(fù)對(duì)照？結(jié)果都類似嗎？

不會(huì)是污染的問(wèn)題，我這對(duì)引物試了多次都是這個(gè)結(jié)果，內(nèi)參引物的擴(kuò)增是正常的。謝謝你的答復(fù)

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4樓2014-02-20 00:53:02

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3樓: Originally posted by forrestgump at 2014-02-19 22:31:06
1）濃度太高了；2）就沒(méi)有進(jìn)行PCR酶活性成了問(wèn)題；3）說(shuō)不清的因素。

我試了降低引物和模板的量，但是結(jié)果都一樣。酶沒(méi)有問(wèn)題的。謝謝您的答復(fù)

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5樓2014-02-20 00:54:15

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6樓: Originally posted by jiaolong11a at 2014-02-20 08:35:32
感覺(jué)你的PCR產(chǎn)物很小啊，溶解曲線不會(huì)是引物二聚體的吧

感覺(jué)是不大，但是二聚體的是不是沒(méi)有這么大��？

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7樓2014-02-21 10:00:11

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lvbobo823

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你看一下你的定量反應(yīng)的循環(huán)溫度延長(zhǎng)時(shí)間有沒(méi)有問(wèn)題？我們實(shí)驗(yàn)室之前有個(gè)同學(xué)做定量選擇fast reaction導(dǎo)致定量上沒(méi)有擴(kuò)增。

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hehe

9樓2014-02-22 20:04:52

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atlanticwi

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...
Melt curve中的值太低，絕度不是需要的擴(kuò)增產(chǎn)物，引物二聚體的可能很大。你如果覺(jué)得有疑問(wèn)，大可拿此產(chǎn)物跑2~3%的瓊脂糖膠看一下，看看分子量大小。
如有說(shuō)錯(cuò)，請(qǐng)高手指正

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Let God do with it as He wills

10樓2014-02-23 02:10:20

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