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湖畔狂想金蟲 (小有名氣)
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[求助]
菌液PCR的假陽性是什么原因造成的？
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最近做實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到這樣的問題： 將目的片段與表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，對其菌液PCR驗(yàn)證時(shí)有目的條帶（同時(shí)還做了用水替代菌液的陰性對照，結(jié)果沒有目的條帶），但是再用酶切驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒有切下目的片段。 想知道這算假陽性嗎？是什么原因造成的？ 求高人指點(diǎn)！萬分感謝！ |
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gyesang
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3樓2014-02-22 12:53:38
鬼羽帝魂
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以下均為網(wǎng)絡(luò)資源： 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出 PCR 產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR 方法來減輕或消除。 |
2樓2014-02-22 10:59:02
4樓2014-02-22 13:48:51
意孤城_
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5樓2014-02-22 15:24:41
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