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[求助] 求幫助設(shè)計(jì)引物啊？已有3人參與

各位做分子的大神，我想克隆一段基因，自己設(shè)計(jì)的引物一直P不出來，求大神幫助設(shè)計(jì)一對合適的啊，前后所加酶切位點(diǎn)分別是Bamh1、EcorR1。

序列（2235bp）是這樣的：
ATGGCGAAGCAAAAAATTAAAATTAAAAAAAATAAAATAGGGGCAGTCCTACTTGTTGGTTTATTCGGACTGCTCTTTTTTATATTGGTTTTAAGAATTTCATATATCATGATTACTGGACATTCTAATGGTCAAGATTTAGTCATGAAGGCAAATGAAAAGTATTTAGTTAAGAATGCACAACAACCAGAACGAGGAAAGATATATGATCGTAATGGTAAAGTGCTAGCAGAAGATGTAGAAAGATATAAACTTGTTGCAGTAATAGATAAAAAGGCGAGTGCCAATTCTAAAAAACCTAGGCATGTAGTTGATAAAAAAGAGACTGCAAAGAAATTATCTACAGTCATTGATATGAAGCCAGAGGAAATTGAAAAGAGACTTAGTCAAAAGAAAGCCTTCCAAATTGAATTTGGACGCAAAGGAACAAATTTAACGTATCAGGACAAATTGAAAATAGAGAAAATGAATTTGCCTGGTATTTCTTTATTGCCTGAAACAGAACGCTTTTATCCAAATGGCAATTTTGCATCACACTTAATTGGTAGAGCTCAGAAAAATCCGGATACTGGTGAACTTAAAGGTGCGCTTGGGGTTGAAAAGATTTTTGATAGTTATTTAAGTGGATCTAAAGGATCATTGAGATATATTCATGATATTTGGGGATATATTGCACCAAATACTAAAAAAGAGAAGCAGCCTAAACGTGGTGATGATGTCCATTTAACAATCGATTCAAATATTCAAGTATTTGTTGAAGAAGCTTTAGATGGCATGGTTGAAAGATACCAGCCGAAAGATTTATTTGCGGTTGTCATGGATGCCAAAACTGGAGAAATTTTAGCATACAGTCAGCGACCAACATTTAATCCTGAAACTGGTAAAGACTTTGGTAAAAAGTGGGCAAATGACCTTTATCAAAACACATACGAGCCTGGATCAACATTTAAATCATATGGGTTAGCAGCTGCTATTCAAGAAGGTGCTTTTGATCCTGATAAGAAATATAAATCTGGACATAGAGATATTATGGGTTCACGTATTTCAGACTGGAATAGAGTCGGTTGGGGTGAAATCCCAATGTCACTCGGATTTACTTATTCATCTAATACATTGATGATGCATTTACAAGATTTAGTTGGTGCAGACAAAATGAAATCTTGGTATGAACGATTTGGATTTGGAAAATCAACTAAAGGTATGTTTGATGGAGAAGCACCTGGTCAAATTGGATGGAGTAATGAGTTGCAACAAAAAACGTCATCATTTGGTCAATCGACAACAGTAACACCTGTTCAAATGTTACAAGCGCAATCAGCGTTCTTTAATGATGGTAATATGTTAAAACCATGGTTTGTGAATAGCGTTGAAAATCCTGTTAGTAAAAGACAATTTTATAAAGGTCAAAAACAAATCGCAGGCAAACCAATAACAAAAGATACTGCTGAAAAAGTTGAAAAGCAATTGGATTTAGTTGTGAATAGTAAGAAGAGTCACGCTGCAAACTATCGTATTGATGGTTATGAGGTCGAAGGTAAGACTGGTACAGCACAAGTCGCTGCACCTAATGGTGGTGGATACGTTAAAGGTCCAAACCCATATTTTGTAAGTTTTATGGGTGACGCGCCGAAGAAAAATCCTAAAGTTATTGTATACGCTGGTATGAGCTTGGCACAAAAAAATGACCAAGAAGCTTATGAATTAGGTGTTAGTAAAGCGTTTAAACCAATAATGGAAAATACTTTGAAATATTTAAATGTAGGTAAATCAAAAGATGACACATCTAATGCAGAGTATAGTAAAGTGCCAGATGTTGAAGGTCAAGACAAACAAAAAGCTATTGATAATGTGAGTGCAAAATCATTAGAACCAGTTACTATCGGTTCTGGCACACAAATAAAAGCGCAATCTATAAAAGCAGGGAATAAAGTCTTACCTCATAGTAAAGTACTGTTATTAACAGATGGAGACTTAACTATGCCTGACATGTCAGGATGGACGAAAGAAGATGTCATTGCTTTTGAAAACCTAACAAATATTAAAGTAAATTTAAAAGGTAGCGGTTTTGTGTCCCACCAATCAATTAGTAAGGGACAAAAACTTACTGAAAAAGATAAAATAGACGTAGAATTTTCATCAGAGAATGTAGACAGCAATTCGACGAATAATTCTGATTCAAATTCAGATGATAAGAAGAAATCTGACAGTAAAACTGACAAGGATAAGTCGGACTAA

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1樓 2014-02-27 21:04:57

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forrestgump

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這是短閱碼框，別無選擇啰，直接在5‘端家酶切位點(diǎn)就是了。只不過基因有點(diǎn)大，走cDNA因此有點(diǎn)難吧了。

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2樓2014-02-28 00:07:56

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引用回帖:

2樓: Originally posted by forrestgump at 2014-02-28 00:07:56
這是短閱碼框，別無選擇啰，直接在5‘端家酶切位點(diǎn)就是了。只不過基因有點(diǎn)大，走cDNA因此有點(diǎn)難吧了。

請問前后該截多長呢？特別是前面重復(fù)A這部分，不知道該怎么辦。請問除了c DNA還有別的什么方法嗎？

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3樓2014-02-28 08:44:56

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jiaolong11a

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2014-02-28 11:45:47

我們一般都是直接取頭尾各加上酶切位點(diǎn)共39個(gè)堿基，都能擴(kuò)出來

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多情總被無情擾。。。愁

4樓2014-02-28 08:58:46

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引用回帖:

4樓: Originally posted by jiaolong11a at 2014-02-28 08:58:46
我們一般都是直接取頭尾各加上酶切位點(diǎn)共39個(gè)堿基，都能擴(kuò)出來

謝謝回復(fù)，保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+序列=39這樣嗎？
按照一般的引物設(shè)計(jì)原則，39感覺很大呢

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5樓2014-02-28 09:08:27

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forrestgump

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引用回帖:

3樓: Originally posted by windleakey at 2014-02-28 08:44:56
請問前后該截多長呢？特別是前面重復(fù)A這部分，不知道該怎么辦。請問除了c DNA還有別的什么方法嗎？...

往5‘RACE方向延伸序列，否則多A肯定不合適，快發(fā)金幣！

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6樓2014-02-28 10:41:22

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jiaolong11a

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引用回帖:

5樓: Originally posted by windleakey at 2014-02-28 09:08:27
謝謝回復(fù)，保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+序列=39這樣嗎？
按照一般的引物設(shè)計(jì)原則，39感覺很大呢...

對，我們只有在擴(kuò)增基因時(shí)這樣做。39個(gè)基因中光酶切位點(diǎn)就占10來個(gè)，如果靶位點(diǎn)序列太少的話，會(huì)結(jié)合不穩(wěn)。你先試試吧。不過你這個(gè)A確實(shí)多，不知有影響嗎

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多情總被無情擾。。。愁

7樓2014-02-28 11:23:18

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lvbobo823

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-02-28 21:39:25

你可以把基因往兩端再擴(kuò)大些合成引物，再一個(gè)你可以試試先不加酶切位點(diǎn)把序列先得到克隆到T載體再在載體上擴(kuò)會(huì)簡單些。

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hehe

8樓2014-02-28 20:47:37

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