 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4014 | 回復(fù): 13 | ||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||
qianbudiaoa新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
原核表達(dá)蛋白量很低 已有6人參與
|
|||
|
原核表達(dá)融合蛋白量很低,不知道是什么原因.嘗試過很多優(yōu)化表達(dá)條件的方法都不行,不知道是不是存在其他表達(dá)量低的原因,求指教. 先簡單介紹下我表達(dá)的信息吧：載體是pet—28a（+），表達(dá)菌株為BL21 ，沒有信號肽序列，蛋白為包涵體形式存在于沉淀中，帶有his標(biāo)簽， 再介紹下我表達(dá)的方法：提前一晚搖菌，第二天轉(zhuǎn)接，到OD0.8 時加入IPTG誘導(dǎo)過夜，離心后倒掉上清，pbs懸浮沉淀后-80度冰箱凍存一夜，第二天加溶菌酶孵化2小時，超聲破碎，離心后沉淀用wash buffer洗滌后離心，得到的沉淀重懸于2M尿素的PBS中，-20度凍存2~3h，然后跑SDSPAGE電泳，結(jié)果是蛋白表達(dá)量很低。 以下說說我做過的嘗試:不同溫度誘導(dǎo),37度,30度,25度都做過,37度完全沒有表達(dá),30度和25度表達(dá)量很低而且差不多. 不同IPTG濃度誘導(dǎo)，0，50，100，200，300，400mM /ml 濃度梯度25度誘導(dǎo)過夜，都有表達(dá)但是表達(dá)量都很低而且沒有明顯差異。 誘導(dǎo)時間，4h，8h，12h，16h，24h都做過，表達(dá)量還是都很低，也看不出來時間不夠還是時間太長蛋白降解了。 還有一個轉(zhuǎn)速的問題，只用過250rpm，不知道降低轉(zhuǎn)速會不會有影響，打算下個星期嘗試一下。 實(shí)在是不知道為什么表達(dá)量很低了，問了身邊的很多人，方法都嘗試過了，還是沒有進(jìn)展，求做過類似實(shí)驗(yàn)，遇到過類似問題的能給我指導(dǎo)一下，不勝感激。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
» 猜你喜歡
【求調(diào)劑】新能源材料本科，一志愿211，初試321
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料考研調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
英一數(shù)一408，總分284，二戰(zhàn)真誠求調(diào)劑
已經(jīng)有14人回復(fù)
-
085410 一志愿211 22408分?jǐn)?shù)359求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
271求調(diào)劑
已經(jīng)有19人回復(fù)
-
385分 生物學(xué)（071000）求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
一志愿安徽大學(xué)計算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)碩，331分求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
318求調(diào)劑，計算材料方向
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
291求調(diào)劑
已經(jīng)有25人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 做了原核表達(dá)，表達(dá)量很低，求助~~
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 求助：兩種蛋白融合原核表達(dá)的問題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時用多少度合適？
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 目的蛋白表達(dá)量低
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 原核表達(dá)蛋白純化
已經(jīng)有32人回復(fù)
- 原核表達(dá)蛋白復(fù)性的具體方案
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 蛋白分子量的表示
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 原核表達(dá)誘導(dǎo)蛋白
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 蛋白分子量大小與它的表達(dá)量相關(guān)嗎？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 大量培養(yǎng) 誘導(dǎo) 蛋白沒有差異表達(dá)
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 原核表達(dá)分子量問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 蛋白表達(dá)分子量偏大
已經(jīng)有25人回復(fù)
- 原核表達(dá)和SDS-PAGE
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 蛋白的表達(dá)量低不穩(wěn)定怎么辦
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 關(guān)于Pet28a載體構(gòu)建的質(zhì)粒，蛋白表達(dá)量低是怎么回事。請大家?guī)兔?/a>
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 原核表達(dá)蛋白分子量大小
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑的選擇
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 蛋白表達(dá)量的提高
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【資料】studier的自動誘導(dǎo)系統(tǒng)---原核誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，無需IPTG
已經(jīng)有125人回復(fù)
- pET-28a原核不能表達(dá)目的蛋白
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 原核表達(dá) PET-30載體 目的蛋白分子量偏��？
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 關(guān)于用Ni-NTA His.bind樹脂純化原核表達(dá)蛋白
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 原核表達(dá)中SDS-PAGE上樣量如何確定？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 蛋白表達(dá)量少 怎么辦
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達(dá)蛋白分子量偏大
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】大腸桿菌中蛋白表達(dá)量偏低，大家有什么建議？
已經(jīng)有28人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白誘導(dǎo)表達(dá)不出目標(biāo)條帶
已經(jīng)有41人回復(fù)
wh6125
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 31
- 帖子: 43
- 在線: 67.8小時
- 蟲號: 2233603
- 注冊: 2013-01-10
- 專業(yè): 園林學(xué)
4樓2014-03-17 13:36:27
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
2樓2014-03-16 21:49:24
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youlinglyw: 金幣+2, 感謝經(jīng)驗(yàn)分享 2014-03-18 17:15:24
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youlinglyw: 金幣+2, 感謝經(jīng)驗(yàn)分享 2014-03-18 17:15:24
|
在不更換載體的表達(dá)菌株的情況下，看你已經(jīng)優(yōu)化了表達(dá)溫度，IPTG濃度等 還可以優(yōu)化的有： 1. 提高誘導(dǎo)的OD，看你是包涵體表達(dá)，所以可以嘗試OD1.0 或者1.2進(jìn)行誘導(dǎo) 2. 優(yōu)化培養(yǎng)基，一個是采用富營養(yǎng)培養(yǎng)基，如TB(Terrific Broth)等，另一個是更換培養(yǎng)基的碳源，向培養(yǎng)基中加入甘油等 3. 還有就是你有沒有分析過蛋白的編碼序列，是不是稀有密碼子過多？如果稀有密碼子多的話，可以更換表達(dá)菌株，變?yōu)镽osseta，或者進(jìn)行密碼子優(yōu)化（點(diǎn)突變或者全基因合成） |
3樓2014-03-17 10:30:43
c_jade
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 91.9
- 帖子: 40
- 在線: 19.6小時
- 蟲號: 656458
- 注冊: 2008-11-17
- 專業(yè): 生物化學(xué)
5樓2014-03-17 16:02:21
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 建環(huán)，能源，土木老師路過看一看！��！ +4 | 嘿嘿uu 2026-04-01 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 找調(diào)劑 +5 | 楚喬喬 2026-04-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601一志愿中山大學(xué)深圳材料工程330求調(diào)劑 +6 | pipiver 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[基金申請] esi高被引論文是不是能對中標(biāo)有所加分和幫助呢 +3 | redcom 2026-04-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 省雙一流重點(diǎn)一本大學(xué)招收調(diào)劑 +4 | wwwwffffff 2026-03-31 | 7/350 |
|
|
[考研] 一志愿中國科學(xué)院大學(xué)265求調(diào)劑 +8 | 恬淡ye 2026-03-31 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑一志愿北航070300，本科鄭大化學(xué) +8 | 圣日耳曼條 2026-04-01 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +7 | BrightLL 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 物理學(xué)調(diào)劑
+4
|
小羊36 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 英一數(shù)一總分334求調(diào)劑 +4 | 陳陽坤 2026-03-31 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 +16 | kikiki7 2026-03-30 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 083000環(huán)境科學(xué)與工程調(diào)劑，總分281 +4 | 橙子（勝意） 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +6 | 丹青奶蓋 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +13 | 是妍子也是研子 2026-03-30 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +10 | 彼岸t 2026-03-29 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動285求調(diào)劑 +7 | AZMK 2026-03-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +10 | jjjjjjjjjjl 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +11 | 陽陽哇塞 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院-光纖傳感課題組招生-中國科學(xué)院大學(xué)、深圳理工大學(xué)聯(lián)培 +5 | YangTyu1 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
085602化學(xué)工程求調(diào)劑。
+4
|
平樂樂樂 2026-03-26 | 4/200 |
|