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a小孩子新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR引物一大堆CG，跪求大神們支招 已有1人參與
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| 我用PET-28a載體，設(shè)計(jì)的引物序列是TTAGGATCC---ATGTGCGAGCCCGGGGACATTAC，這是mRNA,在各種數(shù)據(jù)里都找不到ATG前面的序列，用這個(gè)作為上游引物能不能P出來呀？還有其他的什么辦法能把這發(fā)夾解開嗎？跪求…………急…………謝謝各位大俠！ |
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tu475575025
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-22 22:40:39
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-22 22:40:39
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給你出個(gè)主意： 1、設(shè)計(jì)一對(duì)有突變的引物，5端帶上你要的GC，發(fā)夾結(jié)構(gòu)處適當(dāng)突變一兩個(gè)堿基，3端再多加幾個(gè)互補(bǔ)堿基，這個(gè)就避免了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，應(yīng)該是可以p出來，但是p出來的基因讀碼可能應(yīng)為一兩個(gè)堿基的突變而出錯(cuò)（如果你考慮一下密碼子，看有沒可能設(shè)計(jì)無義突變來避免發(fā)夾）； 2、然后就是用你現(xiàn)在的引物以上一輪突變的產(chǎn)物做模板來擴(kuò)增，特異性肯定很高（除了你突變的一兩個(gè)堿基，都能完全互補(bǔ)） ps：用簡(jiǎn)單的模板（質(zhì)粒、純化的pcr產(chǎn)物）可以減少錯(cuò)配，不用復(fù)雜的。 同是被實(shí)驗(yàn)虐，這是我的經(jīng)驗(yàn)，祝成功！ |
4樓2014-03-22 19:51:16
tu475575025
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
a小孩子(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-20 17:01:51
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a小孩子(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-20 17:01:51
| AGCCCGGGGA包含SmaI位點(diǎn)，我最近的引物也總是出現(xiàn)這個(gè)問題，你可以在5‘上用AT來平衡，5‘的發(fā)夾也沒有什么關(guān)系，只要3’有十幾bp互補(bǔ)都是可以p出來的，但一定確保3’與模板互補(bǔ)的十幾bp沒有發(fā)夾! 另外在5‘加堿基時(shí)要考慮錯(cuò)配，盡量避免錯(cuò)配，同時(shí)平衡Tm值。沒有ATG前面的序列也沒有關(guān)系，你只要ATG下游的序列吧。 |
2樓2014-03-20 15:31:26
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3樓2014-03-21 16:37:09
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