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笑笑打dota金蟲 (小有名氣)
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菌落PCR有目的條帶，重組質(zhì)粒提取PCR卻沒條帶，請問是什么原因？ 已有3人參與
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| 菌落PCR有目的條帶，重組質(zhì)粒PCR卻沒條帶，然后提取質(zhì)粒跑電泳，也沒觀察到重組之后大小的目的條帶，有很多雜帶，請問可能是什么原因啊？ |
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gyesang: 回帖置頂 2014-03-31 20:01:18
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直接在平板上挑菌落是可能沾到平板上你轉(zhuǎn)化時用的DNA，所以你p出來可能全是陽性。你一定要用菌體做pcr建議先挑出來在1.5ml ep管里少量（500ul左右）培養(yǎng)一點(diǎn)，再用菌體做pcr，或者直接做菌液pcr。另外，如果你的插入片段夠大（1k以上）的話，你可以直接跑菌液電泳，以空質(zhì)粒（不要用線性的喲）作對比，如果是陽性轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒會滯后（重組質(zhì)粒比空質(zhì)粒大）。 菌液電泳：裂解液為2%SDS和0.4M NaoH1：1混合 裂解液10ul+菌液20ul 裂解2-5min后加入2ul溴酚藍(lán)，全部點(diǎn)孔（制大孔的膠，不要放在緩沖液中點(diǎn)），觀察質(zhì)粒滯后的轉(zhuǎn)化子一般就是你的陽性。 |
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笑笑打dota8樓2014-03-23 21:13:23
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