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[求助] 菌液PCR為什么有雜帶而且挺亮的已有2人參與

到底是怎么回事呢，我的目的條帶1100左右。marker分別為250 500 1000 1500 2000 2500，中間最亮的是我做的陽(yáng)性對(duì)照，最后面的孔是陰性對(duì)照，連接的PMD18T ，PCR反應(yīng)條件為94度 5min ，94度30秒，55度30秒，55度 1 min， 72度 7min。

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1樓 2014-03-21 10:14:50

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西門吹雪170

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都是非特異性條帶，建議重新連接轉(zhuǎn)化，或者從頭開始，擴(kuò)增時(shí)可以適當(dāng)提高退火溫度

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2樓2014-03-21 10:26:23

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hg30717580

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建議提高退火溫度，減少延長(zhǎng)時(shí)間。試試看

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3樓2014-03-21 16:46:33

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 西門吹雪170 at 2014-03-21 10:26:23
都是非特異性條帶，建議重新連接轉(zhuǎn)化，或者從頭開始，擴(kuò)增時(shí)可以適當(dāng)提高退火溫度

這種情況是沒連上的可能性大，還是沒有PCR出來的可能性大呢

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4樓2014-03-21 18:02:45

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我后來提質(zhì)粒，做了單酶切，發(fā)現(xiàn)條帶比空載體序列要大，拿去測(cè)序，回來又發(fā)現(xiàn)是空載體和些其他序列，也不是我的目的片段，是怎么回事呢？

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5樓2014-03-21 18:05:51

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jyfxmc(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 19:43:07

引用回帖:

5樓: Originally posted by jyfxmc at 2014-03-21 18:05:51
我后來提質(zhì)粒，做了單酶切，發(fā)現(xiàn)條帶比空載體序列要大，拿去測(cè)序，回來又發(fā)現(xiàn)是空載體和些其他序列，也不是我的目的片段，是怎么回事呢？...

你在雙酶切前有進(jìn)行PCR驗(yàn)證嗎？沒的話建議先驗(yàn)證一下，不過以你測(cè)序結(jié)果來看，建議重新來過

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6樓2014-03-21 20:57:20

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