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windleakey金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
PCR產(chǎn)物連T載體轉(zhuǎn)化后，陽(yáng)性率低 已有3人參與
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RT，最近實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連T載體，轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性率總是很低，挑10個(gè)單克隆做PCR可能只有一個(gè)是陽(yáng)性的，雖然能得到想要的，但還是覺(jué)得很奇怪，不知道是什么原因。 請(qǐng)問(wèn)有大神知道嗎？ |
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tu475575025
新蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
windleakey: 金幣+5, ★★★★★最佳答案 2014-03-24 12:32:05
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沒(méi)有遇到過(guò)這種情況，連T載體效率相當(dāng)高，經(jīng)常會(huì)做，每次隨便挑一個(gè)白斑就是陽(yáng)性，后來(lái)索性不用怎么驗(yàn)證了。你可以從以下方面一個(gè)個(gè)排查： 1、感受態(tài)和轉(zhuǎn)化方法，用完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試試，如果轉(zhuǎn)化效率很高，說(shuō)明這部分沒(méi)有問(wèn)題。 2、確認(rèn)你做pcr的酶是不是會(huì)加A，如果是的，再查下一項(xiàng)。 3、用T載自帶的control insert 連接T截試試，如果出現(xiàn)效率很低，可能就是你的T截或者solution I 出問(wèn)題了。 4、再要排查就要換新的T載和solution I試試了 ps：你說(shuō)每次要挑10來(lái)個(gè)轉(zhuǎn)化子才有一個(gè)陽(yáng)性，轉(zhuǎn)化子很多嘛，說(shuō)明你的轉(zhuǎn)化效率還是很高，只是很多是載體自連而已，這個(gè)可以用藍(lán)白斑來(lái)排除呀。猜測(cè)是你連接時(shí)T載用量過(guò)多，插入片段量少了（如果T載正常全部是線性）。也可能是你的載體出問(wèn)題了，連接前就有很多已經(jīng)環(huán)化了（可以直接轉(zhuǎn)1ul 沒(méi)有連接的T載試試）。 |
9樓2014-03-23 21:32:29
Lau_Kimura
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2樓2014-03-22 23:27:47
wangguosing
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3樓2014-03-23 09:22:24
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4樓2014-03-23 10:05:02
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