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windleakey金蟲 (小有名氣)
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PCR產(chǎn)物連T載體轉(zhuǎn)化后，陽性率低 已有3人參與
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RT，最近實驗發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連T載體，轉(zhuǎn)化后陽性率總是很低，挑10個單克隆做PCR可能只有一個是陽性的，雖然能得到想要的，但還是覺得很奇怪，不知道是什么原因。 請問有大神知道嗎？ |
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tu475575025
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沒有遇到過這種情況，連T載體效率相當高，經(jīng)常會做，每次隨便挑一個白斑就是陽性，后來索性不用怎么驗證了。你可以從以下方面一個個排查： 1、感受態(tài)和轉(zhuǎn)化方法，用完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試試，如果轉(zhuǎn)化效率很高，說明這部分沒有問題。 2、確認你做pcr的酶是不是會加A，如果是的，再查下一項。 3、用T載自帶的control insert 連接T截試試，如果出現(xiàn)效率很低，可能就是你的T截或者solution I 出問題了。 4、再要排查就要換新的T載和solution I試試了 ps：你說每次要挑10來個轉(zhuǎn)化子才有一個陽性，轉(zhuǎn)化子很多嘛，說明你的轉(zhuǎn)化效率還是很高，只是很多是載體自連而已，這個可以用藍白斑來排除呀。猜測是你連接時T載用量過多，插入片段量少了（如果T載正常全部是線性）。也可能是你的載體出問題了，連接前就有很多已經(jīng)環(huán)化了（可以直接轉(zhuǎn)1ul 沒有連接的T載試試）。 |
9樓2014-03-23 21:32:29
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