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youyouzi2010銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
GST包涵體蛋白復(fù)性后掛不上柱子，急急急~~
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各位哥哥姐姐，我做的蛋白是37KD的，加上GST標簽是65kd左右，目前我的蛋白已經(jīng)表達出來了，是包涵體，無論是od=0.3 低濃度IPTG+低溫過夜，蛋白都是包涵體。由于純化出來要上動物，就選擇了尿素純化。 我菌體是用溶菌酶+超聲裂解400W,超3停5，之后沉淀再用核酸酶處理。 我先用2M的尿素洗滌沉淀，再用8M的尿素溶解沉淀，尿素都是溶解在50mM的tris-hcl中。 再用透析去除尿素，并且復(fù)性。 我的透析液是PBS， 我的透析的尿素梯度是4M 2M 0.2M 0 PH梯度是8.2 7.8 7.4 7.4 然后透析液上GE的gst FF 柱子 我用的柱子是我?guī)熃懔粝聛淼�，過期了差不多1年 洗脫是10mM的還原性谷胱甘肽， 之后跑膠 發(fā)現(xiàn)洗脫下來的，幾乎沒有我的目的蛋白，只有一點點淺淺的條帶，不仔細看看不出來。 而且我也在樣品里面加了DTT 我隔壁實驗室的說是柱子過期了也能用，說是我復(fù)性的時候GST的構(gòu)象破壞了，到底該怎么辦�。�？我實驗室就我一個做純化 |
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我已經(jīng)透析去掉了尿素，并且更換了4次透析液，里面應(yīng)該沒有尿素了 5樓2014-04-01 10:11:13
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1、GST哪怕是上清表達，結(jié)合能力都是偏弱的； 2、分子量太大，基本不考慮復(fù)性，建議可以嘗試先酶切后，再復(fù)性試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-02-26 11:33:48
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