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[求助] PCR條件，請指導(dǎo)。已有4人參與

大家好，
最近進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小理論值為1580bp，用到的PCR條件為下列兩種：
①94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min；72℃ 10min；
②94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1.5min，72℃ 30s；72℃ 10min；

讓人糾結(jié)的是用①正常的PCR條件嘗試各種方法就是P不出條帶（也做過梯度PCR45-57℃），
但是因?yàn)橐粋€意外PCR條件采用了②條件，擴(kuò)增出了正確的產(chǎn)物。
對此想請教為什么錯誤的條件②可以P出正確產(chǎn)物，且以后的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是不是也需要采�、跅l件。
謝謝！

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1樓 2014-04-06 09:50:44

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感覺是引物Tm值低，或者酶活力不好，循環(huán)中的變性條件94℃/1 min就夠了。

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9樓2014-04-07 10:13:14

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ming0515: 金幣+1, ★★★★★最佳答案 2014-04-07 16:55:43

如果lz兩個pcr條件，只是各個溫度時間長短不一樣，而TM值等其他條件都一樣，那么既然可以得出正確條帶，以后驗(yàn)證時當(dāng)然也用這個條件。

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有些東西因?yàn)榈貌坏蕉兊妹篮�，有些東西因?yàn)閾碛卸兊脧涀阏滟F！

2樓2014-04-06 11:21:19

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apety

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ming0515: 金幣+1 2014-04-07 16:55:56

72℃搞2Min，55℃1Min。話說，你用的的是mix還是自己混合的？

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3樓2014-04-06 12:12:05

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2樓: Originally posted by 867575969 at 2014-04-06 11:21:19
如果lz兩個pcr條件，只是各個溫度時間長短不一樣，而TM值等其他條件都一樣，那么既然可以得出正確條帶，以后驗(yàn)證時當(dāng)然也用這個條件。

關(guān)鍵是，條件②不是正常的PCR條件啊，因?yàn)橥嘶饡r間和延伸時間是相反的。。。

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4樓2014-04-06 12:22:43

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3樓: Originally posted by apety at 2014-04-06 12:12:05
72℃搞2Min，55℃1Min。話說，你用的的是mix還是自己混合的？

自己混合的，正常條帶的延伸時間1Kb/min，
但是用正常的①條件，P不出條帶，而②條件卻可以，對此不懂。

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5樓2014-04-06 12:24:19

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pennchem

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gyesang: 2 2014-04-06 23:47:58
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55°C的時候，Taq酶還是有活性的，就是說55度的時候，除了引物配對之外，還有延伸的作用，只是速度比較慢而已，72度只有延伸，引物和模板是無法配對的。

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行至水窮處，坐看云起時

6樓2014-04-06 16:46:55

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6樓: Originally posted by pennchem at 2014-04-06 16:46:55
55°C的時候，Taq酶還是有活性的，就是說55度的時候，除了引物配對之外，還有延伸的作用，只是速度比較慢而已，72度只有延伸，引物和模板是無法配對的。

那按照您的意思，55℃即進(jìn)行了退火，有包含延伸。那么我的②PCR條件是不是可以去掉72℃ 30s，這一步，從而改成兩步法。

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7樓2014-04-06 21:32:10

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pennchem

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如果你把55度的時間延長足夠，這樣72度這一步就可以省略了。

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行至水窮處，坐看云起時

8樓2014-04-06 22:02:09

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9樓: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-04-07 10:13:14
感覺是引物Tm值低，或者酶活力不好，循環(huán)中的變性條件94℃/1 min就夠了。

看錯了，94℃/30 s

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10樓2014-04-07 10:14:17

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