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nbzhenzhen新蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌培養(yǎng) 質(zhì)粒提取后困惑 已有8人參與
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最近老師要求做 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)的標(biāo)品。老師說(shuō)，用質(zhì)�？寺〉姆椒ㄖ苽溥@樣的標(biāo)品。具體操作如下： 1.JM109 16s RNA基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增（27f-1492r) 2.切膠純化回收 3.目的基因與載體（PMD 19-T vector）的連接：10ul，4℃，過(guò)夜。 4.將連接有目的基因的載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α：50ul感受態(tài)細(xì)胞與10ul以上溶液（第3步的）混合，冰上30min，42℃ 45s，冰上1min，加440ul SOC培養(yǎng)基37℃，180rpm，培養(yǎng)1h。 5.涂布：配制LB培養(yǎng)基，滅菌稍冷卻后，添加1/1000的Amp，倒平板制成固體培養(yǎng)基�；旌�30ul x-gal、7ul IPTG和63ul ddH2O，加至固體平板上，涂布均勻。 取10u l第4步培養(yǎng)液，混合90ul滅菌dd H2O,相當(dāng)于稀釋10倍后，加至固體平板上，涂布均勻。 6.培養(yǎng)：倒置平板，待平板上的冷凝水晾干后，置于37℃，靜置培養(yǎng)過(guò)夜。 7.藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)：取出培養(yǎng)基，挑取白斑至3-4ml LB液體培養(yǎng)基（滅菌冷卻后加1/1000Amp）中，37℃，180rpm，幾個(gè)小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至100ml LB液體培養(yǎng)基中（滅菌冷卻后加1/1000Amp）。37℃，180rpm，16h。 8.質(zhì)粒提�。喝〉�7步培養(yǎng)后的菌液5ml，離心，棄上清。步驟按照TIANGEN質(zhì)粒提取試劑盒。 問(wèn)題就卡在了質(zhì)粒提取后，出現(xiàn)3個(gè)條帶，如圖跑得最快的兩條最亮。問(wèn)過(guò)同實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐，他們說(shuō)未遇到過(guò)這種情況，他們提出來(lái)的質(zhì)粒都是兩條，一條是不亮的基因組DNA，一條是亮的質(zhì)粒。我不知道我的是怎么回事，質(zhì)粒提取操作重復(fù)兩次，仍是一樣的結(jié)果。求解。 E.coli 質(zhì)粒的提取.png |
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殘劍流霜
木蟲 (初入文壇)
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4樓2014-04-15 18:42:47
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