 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2157 | 回復(fù): 25 | ||||
[求助]
3‘RACE序列比對了居然是26S核糖體RNA基因 這是怎么回事 求指點 ！�。。�！萬分感謝 已有4人參與
|
||||
|
應(yīng)用CloneTech Smart RACE試劑盒做3’RACE 應(yīng)用試劑盒的UPM引物基因特異性引物 退火58度 延伸2min 得到了750bp 和300bp 的條帶 測序 結(jié)果都是26S核糖體RNA基因 ，不是我要的基因序列 請問我到底哪里出了錯？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有192人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 急急急....BD SMART 3RACE條帶不全
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 基因克隆得不到全長
已經(jīng)有2人回復(fù)
- 為什么我擴增3‘RACE出來三個片段，都有ploy A 結(jié)構(gòu)
已經(jīng)有9人回復(fù)
- RACE 問題 求助大家
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 做RACE老是出現(xiàn)非特異擴增，求助！
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 如何確定mRNA的非編碼區(qū)
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 想請教一下做RACE時，特異性引物的設(shè)計問題，以及如何根據(jù)同源保守區(qū)設(shè)計引物？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 怎樣判斷一個新基因序列完不完整呢？
已經(jīng)有0人回復(fù)
- RACE5‘一直做不出來怎么辦？
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】基因克隆
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于基因克隆寫文章的問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
karin
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 18 (小學(xué)生)
- 金幣: 2959.6
- 紅花: 3
- 帖子: 208
- 在線: 178.5小時
- 蟲號: 1393514
- 注冊: 2011-09-07
- 性別: MM
- 專業(yè): 農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yoyo單眼皮: 金幣+8, ★★★很有幫助 2014-04-24 21:30:25
yoyo單眼皮: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-05-05 16:07:17
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yoyo單眼皮: 金幣+8, ★★★很有幫助 2014-04-24 21:30:25
yoyo單眼皮: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-05-05 16:07:17
|
我最近也在用CloneTech Smart RACE試劑盒做5’RACE ，換了若干引物，用的touch-down PCR，測了若干2kb、1kb、750bp、500bp條帶，都是核糖體28s，18s，5.8s基因簇里的片段。后來我拿自己的基因和這個基因簇對比了一下，確實有相似度高的部分，后來就選擇相似度低的部分設(shè)計特異引物，目前正在做，反正不再出以前那些明顯不對的條帶了。 你可以也比對一下，是不是和我的情況類似呢，還有就是設(shè)計特引物的時候選擇Tm值高的，以便做touch-down PCR。當(dāng)參考吧，祝你早日成功！  |
5樓2014-04-24 11:11:33
karin
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 18 (小學(xué)生)
- 金幣: 2959.6
- 紅花: 3
- 帖子: 208
- 在線: 178.5小時
- 蟲號: 1393514
- 注冊: 2011-09-07
- 性別: MM
- 專業(yè): 農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)
yoyo單眼皮7樓2014-04-26 10:04:12
biostar2009
專家顧問 (正式寫手)
-
專家經(jīng)驗: +220 - MolEPI: 20
- 應(yīng)助: 231 (大學(xué)生)
- 金幣: 10391.9
- 散金: 387
- 紅花: 63
- 帖子: 540
- 在線: 151.9小時
- 蟲號: 2811882
- 注冊: 2013-11-19
- 專業(yè): 生物化學(xué)
- 管轄: 分子生物
17樓2014-05-08 19:04:53
biostar2009
專家顧問 (正式寫手)
-
專家經(jīng)驗: +220 - MolEPI: 20
- 應(yīng)助: 231 (大學(xué)生)
- 金幣: 10391.9
- 散金: 387
- 紅花: 63
- 帖子: 540
- 在線: 151.9小時
- 蟲號: 2811882
- 注冊: 2013-11-19
- 專業(yè): 生物化學(xué)
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-04-23 17:34:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-04-23 17:34:18
|
仔細(xì)分析你得到的序列，你找到了非模板A么？ 看看這個： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592 |
2樓2014-04-23 16:01:45
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時
- 蟲號: 322365
- 注冊: 2007-03-11
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
3樓2014-04-23 16:05:34
4樓2014-04-23 16:34:30
6樓2014-04-24 21:31:02
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
-
專家經(jīng)驗: +218 - MolEPI: 44
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時
- 蟲號: 1766465
- 注冊: 2012-04-19
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yoyo單眼皮: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-05-05 16:06:08
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵熱心回帖交流 2014-05-05 20:24:25
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yoyo單眼皮: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-05-05 16:06:08
西門吹雪170: 金幣+5, 鼓勵熱心回帖交流 2014-05-05 20:24:25
|
這實際上就是PCR擴增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴增帶，其原因與對策如下： I.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少。可能的具體原因和對策如下： 1.設(shè)立陽性和陰性對照，檢查反應(yīng)體系是否被污染。如果被污染則采用相應(yīng)的對策消除污染。具體見“二”。 2.加強DNA聚合酶的專一性。 （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴增不夠。改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 3.縮短退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 4.采用使用專一性更強的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。 （1）使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增時，非特異性擴增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 （2）使用熱啟動模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 5.適當(dāng)減少DNA模板量和四中脫氧核苷酸的濃度也能夠一定程度上減少非特異性擴增。 II.反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風(fēng)，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新設(shè)引物了。本文是2013年11月8日重新編輯的。 |
8樓2014-04-26 10:18:50
9樓2014-05-05 16:06:50
10樓2014-05-08 16:57:32
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 yoyo單眼皮 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +18 | 超級伊昂大王 2026-03-24 | 20/1000 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +8 | Y-cap 2026-03-29 | 11/550 |
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)材料與化工（085600）296求調(diào)劑 +25 | 稻妻小編 2026-03-26 | 25/1250 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +7 | 藍(lán)月亮亮 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 105500藥學(xué)求調(diào)劑，一志愿山東大學(xué)藥學(xué)，348分
+3
|
gr哈哈哈 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085602 化學(xué)工程專碩 340分求調(diào)劑 +4 | qianbai11 2026-03-29 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +10 | 彼岸t 2026-03-29 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 337求調(diào)劑 +6 | 《樹》 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 318一志愿吉林大學(xué)生物與醫(yī)藥 求調(diào)劑 +5 | 篤行致遠(yuǎn). 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京工業(yè)大學(xué)，324分求調(diào)劑 +6 | 零八# 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +4 | 種圣賜 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 崔wj 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿太原理工安全工程300分，求調(diào)劑 +5 | 0857求調(diào)劑. 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動285求調(diào)劑 +7 | AZMK 2026-03-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 壓國家一區(qū)線，求導(dǎo)師收留，有恩必謝！ +7 | 迷人的哈哈 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 086000調(diào)劑 +3 | 7901117076 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分調(diào)劑 +4 | 大饞小子 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 李嘉圖·S·路 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 打過很多競賽，085406控制工程300分，求調(diào)劑 +3 | askeladz 2026-03-26 | 3/150 |
|