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[求助]
3‘RACE序列比對了居然是26S核糖體RNA基因 這是怎么回事 求指點 �。。。。∪f分感謝 已有4人參與
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應(yīng)用CloneTech Smart RACE試劑盒做3’RACE 應(yīng)用試劑盒的UPM引物基因特異性引物 退火58度 延伸2min 得到了750bp 和300bp 的條帶 測序 結(jié)果都是26S核糖體RNA基因 ，不是我要的基因序列 請問我到底哪里出了錯？ |
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我最近也在用CloneTech Smart RACE試劑盒做5’RACE ，換了若干引物，用的touch-down PCR，測了若干2kb、1kb、750bp、500bp條帶，都是核糖體28s，18s，5.8s基因簇里的片段。后來我拿自己的基因和這個基因簇對比了一下，確實有相似度高的部分，后來就選擇相似度低的部分設(shè)計特異引物，目前正在做，反正不再出以前那些明顯不對的條帶了。 你可以也比對一下，是不是和我的情況類似呢，還有就是設(shè)計特引物的時候選擇Tm值高的，以便做touch-down PCR。當(dāng)參考吧，祝你早日成功！  |
5樓2014-04-24 11:11:33
karin
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仔細(xì)分析你得到的序列，你找到了非模板A么？ 看看這個： http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592 |
2樓2014-04-23 16:01:45
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這實際上就是PCR擴(kuò)增后目的帶未出現(xiàn)而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶，其原因與對策如下： I.引物的特異性差，受非特異性的PCR擴(kuò)增的競爭性抑制作用的影響，靶基因的PCR擴(kuò)增效率低，特異性的PCR產(chǎn)物極少�？赡艿木唧w原因和對策如下： 1.設(shè)立陽性和陰性對照，檢查反應(yīng)體系是否被污染。如果被污染則采用相應(yīng)的對策消除污染。具體見“二”。 2.加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性。 （1）Taq DNA聚合酶的專一性擴(kuò)增不夠。改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 （3）在反應(yīng)體系中加入：1.0mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以穩(wěn)定 DNA聚合酶。 3.縮短退火溫度時間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計引物，不要大范圍地變動反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴(kuò)增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復(fù)性溫度降低1-3度。 4.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。 （1）使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，非特異性擴(kuò)增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 （2）使用熱啟動模式�？梢再徺I商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 5.適當(dāng)減少DNA模板量和四中脫氧核苷酸的濃度也能夠一定程度上減少非特異性擴(kuò)增。 II.反應(yīng)體系被污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風(fēng)，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 前面所有措施都不行，那就只好重新設(shè)引物了。本文是2013年11月8日重新編輯的。 |
8樓2014-04-26 10:18:50
9樓2014-05-05 16:06:50
10樓2014-05-08 16:57:32
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