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xiangchou812木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助土壤總DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增 已有5人參與
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最近在做土壤微生物多樣性研究，結(jié)果在總DNA提取和pcr擴(kuò)增上遇到難題。先是買國內(nèi)生物公司的土壤DNA提取試劑盒，使用固氮菌通用引物PolF和PolR為引物，TAKARA的rTaq酶擴(kuò)增，結(jié)果為陰性，懷疑國內(nèi)試劑盒不行，遂換用進(jìn)口MoBio公司強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒，瓊脂糖檢測(cè)條帶挺亮，0D260/280也正常，260/230只有1.2左右，但PCR結(jié)果還是陰性，后又合成細(xì)菌通用引物27F/2492R，直接以DH5a菌液為模板，可以擴(kuò)出預(yù)期大小條帶，但以提取到的土壤DNA為模板，又是陰性。有文獻(xiàn)說Mg2+濃度被土壤腐殖質(zhì)等螯合會(huì)抑制PCR，故在反應(yīng)體系中加入土壤DNA和DH5a菌液混合物為模板，卻可擴(kuò)到明亮做條帶。懷疑土壤保存方法有問題，又從院子草地里取新鮮土樣，提DNA，PCR結(jié)果仍是陰性。來回折騰快一個(gè)月了，總是原地踏步，實(shí)是無語，特求教大神們，問題會(huì)在哪里？感激涕零！ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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xiangchou812: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-04-26 11:20:55
| 首先糾正一下，細(xì)菌通用引物是27F/1492R而非2492，我不知道你怎么擴(kuò)的，DNA條帶檢測(cè)都有，怎么就擴(kuò)不出來？一般簡(jiǎn)單的方法是把DNA樣品稀釋基本都可以解決，或者你直接把DNA純化之后再來做，不知道你的是什么土樣，如果腐殖質(zhì)含量太高，土樣應(yīng)該先用磷酸緩沖液洗一下再提DNA，就說這么多吧，樓主自己看著辦，祝好 |
3樓2014-04-24 09:29:21
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