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載體構(gòu)建，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因全突變，克隆入T載體，菌液PCR全是假陽性 已有5人參與
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| 各位前輩好，本人研一，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室將近一年，最近構(gòu)建真核表達(dá)載體5個(gè)，從細(xì)胞內(nèi)trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用5隊(duì)特異性引物均能擴(kuò)出目的片段，膠回收，回收產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)，雙酶切，連接20小時(shí)，轉(zhuǎn)化，挑菌各12個(gè)，于1.5ml EP管內(nèi)加入500ul LB，搖混，行菌液PCR，電泳結(jié)果均為引物二聚體，反復(fù)做了多次，都是這樣，第四次的時(shí)候出了幾個(gè)陽性的，測(cè)序又顯示全突變，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德萊的 MIX，最后用LA酶擴(kuò)，測(cè)序仍然有突變，關(guān)鍵是，模板是細(xì)胞內(nèi)提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的，怎么會(huì)有突變？求指點(diǎn)，謝謝 |
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4樓2014-05-01 11:25:26
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liuwhlong(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
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全突變是什么意思？是根本不是你想要的基因，還是突變率很高？ 如果不是你要想要的基因， cDNA的PCR產(chǎn)物后直接送去測(cè)序，如果是你想要的基因，繼續(xù)往下做。如果不是你想要的基因，請(qǐng)分析PCR產(chǎn)物序列，找出錯(cuò)配的原因，重新設(shè)計(jì)引物，避開錯(cuò)配。還有就是你選對(duì)了細(xì)胞系了嗎？cDNA是有組織特異性的。建議你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些細(xì)胞系里面表達(dá)相對(duì)高，具體方法自己去看xpression Atlas官方的幫助文檔，不難。 如果是突變率很高， PCR實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的突變率是相當(dāng)?shù)偷�，樓上說了，可以換高保真酶，如果換酶注意這個(gè)酶能否產(chǎn)生A末端，KOD酶不能產(chǎn)生A末端，不能直接連T載體的。 還有基因有很多variant（變異體），還有可能有不同的transcript（轉(zhuǎn)錄本）。它們之間去比較的話，很顯然你會(huì)得出突變很多的結(jié)論。 檢測(cè)是否連接正確，我有一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，比菌落PCR、提取質(zhì)粒后酶切快捷，經(jīng)濟(jì)： 1、挑菌后，搖4h-6h 2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置細(xì)菌裂解液，我比較懶，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer 3、震蕩后離心，取20ul上清電泳，同時(shí)點(diǎn)空質(zhì)粒做對(duì)照。 如果有插入片段的話，會(huì)有比空質(zhì)粒慢一點(diǎn)點(diǎn)的條帶。插入片段在500以上，基本上能分清。 |
5樓2014-05-01 20:43:14
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