 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3810 | 回復: 11 | |||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[求助]
載體構建，測序結果顯示目的基因全突變，克隆入T載體，菌液PCR全是假陽性 已有5人參與
|
|||
| 各位前輩好，本人研一，進入實驗室將近一年，最近構建真核表達載體5個，從細胞內(nèi)trizol法提取總RNA，反轉錄產(chǎn)物作為模板，用5隊特異性引物均能擴出目的片段，膠回收，回收產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，雙酶切，連接20小時，轉化，挑菌各12個，于1.5ml EP管內(nèi)加入500ul LB，搖混，行菌液PCR，電泳結果均為引物二聚體，反復做了多次，都是這樣，第四次的時候出了幾個陽性的，測序又顯示全突變，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德萊的 MIX，最后用LA酶擴，測序仍然有突變，關鍵是，模板是細胞內(nèi)提取的RNA反轉錄得到的，怎么會有突變？求指點，謝謝 |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有257人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 用pMD 19-T做克隆之后用哪對通用引物做菌落PCR以及測序呢？
已經(jīng)有7人回復
- 克隆基因，用PMD19-T載體轉天根的感受態(tài)細胞，菌落少，測的序列全是空載體，求原因·
已經(jīng)有21人回復
- 目的基因連接到克隆載體后提取質粒測序，序列有問題
已經(jīng)有11人回復
- 有用同源重組法進行基因克隆和載體構建的嗎？
已經(jīng)有8人回復
- 做單克隆測序是菌液好還是菌液PCR后測好?
已經(jīng)有9人回復
- 挑單克隆后，菌液PCR檢測所有條帶都偏小，目的條帶沒有出現(xiàn)
已經(jīng)有9人回復
- 我做TA克隆，準備拿序列去測序。做完轉化以后直接做個菌液PCR檢驗一下是否有目的
已經(jīng)有31人回復
- TA克隆，但是PCR的片段幾十bp，最好選用什么T載體呢？
已經(jīng)有7人回復
- 已知全長基因怎樣克隆并構建表達載體
已經(jīng)有8人回復
- 【求助】基因克隆T載體酶切問題等
已經(jīng)有8人回復
- 已知基因全長，克隆構建表達載體
已經(jīng)有5人回復
- 克隆基因連接到載體上測序發(fā)現(xiàn)有一個點突變怎么辦？
已經(jīng)有16人回復
- 克隆基因和載體連接后轉化至大腸桿菌，為什么每次涂板都是空平板沒有菌落？
已經(jīng)有17人回復
- 【求助/交流】核基因 PCR產(chǎn)物直接測序，結果出現(xiàn)單個位點套峰，是否需要做克隆測序
已經(jīng)有9人回復
liuderong
鐵桿木蟲 (正式寫手)
- 應助: 310 (大學生)
- 金幣: 8202.1
- 紅花: 31
- 帖子: 582
- 在線: 142.1小時
- 蟲號: 1882145
- 注冊: 2012-07-07
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學
4樓2014-05-01 11:25:26
zep616745243
銀蟲 (小有名氣)
- 應助: 32 (小學生)
- 金幣: 320.5
- 散金: 20
- 紅花: 1
- 帖子: 210
- 在線: 70.8小時
- 蟲號: 1120444
- 注冊: 2010-10-12
- 性別: GG
- 專業(yè): 獸醫(yī)傳染病學
2樓2014-05-01 00:30:48
鬼羽帝魂
木蟲 (著名寫手)
- 應助: 183 (高中生)
- 金幣: 3100.2
- 散金: 19
- 紅花: 12
- 帖子: 1427
- 在線: 186.8小時
- 蟲號: 2538789
- 注冊: 2013-07-09
- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
3樓2014-05-01 09:38:55
【答案】應助回帖
★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
liuwhlong(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
感謝參與，應助指數(shù) +1
liuwhlong(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
|
全突變是什么意思？是根本不是你想要的基因，還是突變率很高？ 如果不是你要想要的基因， cDNA的PCR產(chǎn)物后直接送去測序，如果是你想要的基因，繼續(xù)往下做。如果不是你想要的基因，請分析PCR產(chǎn)物序列，找出錯配的原因，重新設計引物，避開錯配。還有就是你選對了細胞系了嗎？cDNA是有組織特異性的。建議你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些細胞系里面表達相對高，具體方法自己去看xpression Atlas官方的幫助文檔，不難。 如果是突變率很高， PCR實驗過程中產(chǎn)生的突變率是相當?shù)偷�，樓上說了，可以換高保真酶，如果換酶注意這個酶能否產(chǎn)生A末端，KOD酶不能產(chǎn)生A末端，不能直接連T載體的。 還有基因有很多variant（變異體），還有可能有不同的transcript（轉錄本）。它們之間去比較的話，很顯然你會得出突變很多的結論。 檢測是否連接正確，我有一個簡單的方法，比菌落PCR、提取質粒后酶切快捷，經(jīng)濟： 1、挑菌后，搖4h-6h 2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置細菌裂解液，我比較懶，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer 3、震蕩后離心，取20ul上清電泳，同時點空質粒做對照。 如果有插入片段的話，會有比空質粒慢一點點的條帶。插入片段在500以上，基本上能分清。 |
5樓2014-05-01 20:43:14
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 生物學一志愿985，分數(shù)349求調(diào)劑 +5 | zxts12 2026-03-21 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑，英語六級551，有科研經(jīng)歷 +7 | 生物工程調(diào)劑 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[考研]
 材料與化工考研調(diào)劑
+4
|
孅華 2026-03-22 | 4/200 |
|
|
[考研] 306求0703調(diào)劑一志愿華中師范 +6 | 紙魚ly 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +10 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 石河子大學（211、雙一流）碩博研究生長期招生公告 +3 | 李子目 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +8 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境學碩288求調(diào)劑 +6 | 皮皮皮123456 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿南大，0703化學，分數(shù)336，求調(diào)劑 +3 | 收到VS 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 余意卿 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +10 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調(diào)劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學，080502，354分求調(diào)劑 +5 | 守候夕陽CF 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料專碩英一數(shù)二306 +7 | z1z2z3879 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學，327分，材料與化工085600 +9 | Ncdx123456 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 294求調(diào)劑材料與化工專碩 +15 | 陌の森林 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 廣西大學家禽遺傳育種課題組2026年碩士招生（接收計算機專業(yè)調(diào)劑） +3 | 123阿標 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 +4 | 18889395102 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|