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[求助]
載體構(gòu)建，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因全突變，克隆入T載體，菌液PCR全是假陽(yáng)性 已有5人參與
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| 各位前輩好，本人研一，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室將近一年，最近構(gòu)建真核表達(dá)載體5個(gè)，從細(xì)胞內(nèi)trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用5隊(duì)特異性引物均能擴(kuò)出目的片段，膠回收，回收產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)，雙酶切，連接20小時(shí)，轉(zhuǎn)化，挑菌各12個(gè)，于1.5ml EP管內(nèi)加入500ul LB，搖混，行菌液PCR，電泳結(jié)果均為引物二聚體，反復(fù)做了多次，都是這樣，第四次的時(shí)候出了幾個(gè)陽(yáng)性的，測(cè)序又顯示全突變，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德萊的 MIX，最后用LA酶擴(kuò)，測(cè)序仍然有突變，關(guān)鍵是，模板是細(xì)胞內(nèi)提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的，怎么會(huì)有突變？求指點(diǎn)，謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liuwhlong(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
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全突變是什么意思？是根本不是你想要的基因，還是突變率很高？ 如果不是你要想要的基因， cDNA的PCR產(chǎn)物后直接送去測(cè)序，如果是你想要的基因，繼續(xù)往下做。如果不是你想要的基因，請(qǐng)分析PCR產(chǎn)物序列，找出錯(cuò)配的原因，重新設(shè)計(jì)引物，避開錯(cuò)配。還有就是你選對(duì)了細(xì)胞系了嗎？cDNA是有組織特異性的。建議你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些細(xì)胞系里面表達(dá)相對(duì)高，具體方法自己去看xpression Atlas官方的幫助文檔，不難。 如果是突變率很高， PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的突變率是相當(dāng)?shù)偷�，樓上說(shuō)了，可以換高保真酶，如果換酶注意這個(gè)酶能否產(chǎn)生A末端，KOD酶不能產(chǎn)生A末端，不能直接連T載體的。 還有基因有很多variant（變異體），還有可能有不同的transcript（轉(zhuǎn)錄本）。它們之間去比較的話，很顯然你會(huì)得出突變很多的結(jié)論。 檢測(cè)是否連接正確，我有一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，比菌落PCR、提取質(zhì)粒后酶切快捷，經(jīng)濟(jì)： 1、挑菌后，搖4h-6h 2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置細(xì)菌裂解液，我比較懶，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer 3、震蕩后離心，取20ul上清電泳，同時(shí)點(diǎn)空質(zhì)粒做對(duì)照。 如果有插入片段的話，會(huì)有比空質(zhì)粒慢一點(diǎn)點(diǎn)的條帶。插入片段在500以上，基本上能分清。 |
5樓2014-05-01 20:43:14
【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流！ 2014-05-04 14:31:49
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首先確定是出現(xiàn)兩個(gè)問題，一個(gè)是P不出來(lái)，全是二聚體；在一個(gè)就是測(cè)序發(fā)現(xiàn)不是目的片段 問題回答1：出現(xiàn)引物二聚體的原因有很多，有可能是引物濃度太高，一般用0.5um的濃度就夠了（50ul體系里加1ul 10um濃度的引物），還有可能是是退火溫度太高，試試降低退火溫度的效果，再一個(gè)就是沒有模板。 2、出現(xiàn)測(cè)序結(jié)果不是目的片段的可能原因，要么就是測(cè)序是反向測(cè)的，你比對(duì)的時(shí)候沒有把序列反義過(guò)來(lái)比對(duì)，所以比對(duì)的結(jié)果全是反的，也就是完全對(duì)不上號(hào)。再或者測(cè)序的結(jié)果是載體本身的片段，并不是你的目的片段，所以，選擇測(cè)序引物的時(shí)候也要注意用合適的，如果測(cè)序引物對(duì)于載體的來(lái)講本身就可以P出來(lái)幾百的片段，那可能你的目的片段根本就沒有練上去,P出來(lái)的幾百的片段實(shí)際是載體上的片段 |
9樓2014-05-04 10:48:05
zep616745243
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2樓2014-05-01 00:30:48
鬼羽帝魂
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3樓2014-05-01 09:38:55
liuderong
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4樓2014-05-01 11:25:26
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6樓2014-05-02 20:30:07
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-03 20:33:19
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-03 20:33:19
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第一點(diǎn)，不明白你說(shuō)的全突變是什么意思，是突變了一個(gè)堿基？還是說(shuō)插入的片段根本就不是你想要的； 第二點(diǎn)，其實(shí)你用到的2個(gè)酶應(yīng)該都是Taq類型的，LA別以為是個(gè)好東西，你在擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)有時(shí)候確實(shí)是能夠PCR出來(lái)，但是保真就一般般了，所以我從來(lái)不用這些玩意，除了他們的BUFF； 第三點(diǎn)，突變不一定就是PCR產(chǎn)生的，因?yàn)橛锌赡苣愕哪０寰鸵呀?jīng)是突變了，你說(shuō)的突變肯定是跟你想要的標(biāo)準(zhǔn)序列有出入，沒準(zhǔn)會(huì)是SNP |
7樓2014-05-03 13:47:58
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10樓2014-05-21 22:34:48
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