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載體構(gòu)建，測序結(jié)果顯示目的基因全突變，克隆入T載體，菌液PCR全是假陽性 已有5人參與
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| 各位前輩好，本人研一，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室將近一年，最近構(gòu)建真核表達(dá)載體5個，從細(xì)胞內(nèi)trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用5隊特異性引物均能擴(kuò)出目的片段，膠回收，回收產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，雙酶切，連接20小時，轉(zhuǎn)化，挑菌各12個，于1.5ml EP管內(nèi)加入500ul LB，搖混，行菌液PCR，電泳結(jié)果均為引物二聚體，反復(fù)做了多次，都是這樣，第四次的時候出了幾個陽性的，測序又顯示全突變，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德萊的 MIX，最后用LA酶擴(kuò)，測序仍然有突變，關(guān)鍵是，模板是細(xì)胞內(nèi)提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的，怎么會有突變？求指點(diǎn)，謝謝 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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393658000
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-05-03 20:33:19
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-05-03 20:33:19
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第一點(diǎn)，不明白你說的全突變是什么意思，是突變了一個堿基？還是說插入的片段根本就不是你想要的； 第二點(diǎn)，其實(shí)你用到的2個酶應(yīng)該都是Taq類型的，LA別以為是個好東西，你在擴(kuò)增長片段時有時候確實(shí)是能夠PCR出來，但是保真就一般般了，所以我從來不用這些玩意，除了他們的BUFF； 第三點(diǎn)，突變不一定就是PCR產(chǎn)生的，因?yàn)橛锌赡苣愕哪０寰鸵呀?jīng)是突變了，你說的突變肯定是跟你想要的標(biāo)準(zhǔn)序列有出入，沒準(zhǔn)會是SNP |
7樓2014-05-03 13:47:58
zep616745243
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3樓2014-05-01 09:38:55
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4樓2014-05-01 11:25:26
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