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[求助]
載體構建，測序結果顯示目的基因全突變，克隆入T載體，菌液PCR全是假陽性 已有5人參與
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| 各位前輩好，本人研一，進入實驗室將近一年，最近構建真核表達載體5個，從細胞內(nèi)trizol法提取總RNA，反轉錄產(chǎn)物作為模板，用5隊特異性引物均能擴出目的片段，膠回收，回收產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測，雙酶切，連接20小時，轉化，挑菌各12個，于1.5ml EP管內(nèi)加入500ul LB，搖混，行菌液PCR，電泳結果均為引物二聚體，反復做了多次，都是這樣，第四次的時候出了幾個陽性的，測序又顯示全突變，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德萊的 MIX，最后用LA酶擴，測序仍然有突變，關鍵是，模板是細胞內(nèi)提取的RNA反轉錄得到的，怎么會有突變？求指點，謝謝 |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★
gyesang: 金幣+4, 鼓勵交流！ 2014-05-04 14:31:49
gyesang: 金幣+4, 鼓勵交流！ 2014-05-04 14:31:49
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首先確定是出現(xiàn)兩個問題，一個是P不出來，全是二聚體；在一個就是測序發(fā)現(xiàn)不是目的片段 問題回答1：出現(xiàn)引物二聚體的原因有很多，有可能是引物濃度太高，一般用0.5um的濃度就夠了（50ul體系里加1ul 10um濃度的引物），還有可能是是退火溫度太高，試試降低退火溫度的效果，再一個就是沒有模板。 2、出現(xiàn)測序結果不是目的片段的可能原因，要么就是測序是反向測的，你比對的時候沒有把序列反義過來比對，所以比對的結果全是反的，也就是完全對不上號。再或者測序的結果是載體本身的片段，并不是你的目的片段，所以，選擇測序引物的時候也要注意用合適的，如果測序引物對于載體的來講本身就可以P出來幾百的片段，那可能你的目的片段根本就沒有練上去,P出來的幾百的片段實際是載體上的片段 |
9樓2014-05-04 10:48:05
zep616745243
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4樓2014-05-01 11:25:26
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