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為什么PCR之后的電泳會出現(xiàn)這樣的條帶？圖片不太清楚，左邊三條是內(nèi)參 已有4人參與
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片段長693bp,去年年底P這段基因還好好的~內(nèi)參出來了，說明cDNA沒問題啊 Image1.jpg |
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凌波麗
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【答案】應助回帖
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西門吹雪170: 金幣+10, MolEPI+1, 應助指數(shù)+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-09 09:28:40
西門吹雪170: 金幣+10, MolEPI+1, 應助指數(shù)+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-09 09:28:40
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PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致（作者：凌波麗) 2013年9月24日 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶，其原因與對策如下： I.引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體、或者GC比鄰遠離50%。對策：重新設計引物。 II.Mg2+ 離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。 III.靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因： 1.整個基因組或大片段的交叉污染，導致非特異性帶出現(xiàn)。 這種非特異性帶出現(xiàn)可用以下方法解決： （1）在加樣槍的接頭和吸桿之間加上脫脂消毒棉花，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 （2）除了酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。 （3）所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 （4）重新提取模板DNA。 2.空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有時候可能會互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致非特異性帶出現(xiàn)的產(chǎn)生。雖然這樣的可能性比較小。 對策：實驗前對實驗室充分通風，試驗時盡量加上PCR試劑暴露于空氣中的時間，還可用巢式PCR方法來減輕或消除空氣中的小片段核酸造成的污染，最基本的解決辦法：重新提取模板DNA。 IV.考慮使用熱啟動模式。可以購買商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。 V.調(diào)整變性和退火溫度時間。 VI.更換所有緩沖溶液，使用全部新配的緩沖溶液。這點可能太基本了，很不被重視。 VII.適當調(diào)高復性溫度。沒有重新設計引物，不要大范圍地變動反應體系的復性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動。如果出現(xiàn)非特異性擴增，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復性溫度提高1-3度；如果出現(xiàn)任何擴增帶，則把在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把復性溫度降低1-3度。 VIII.Taq酶的專一性擴增不夠。往往一些來源的DNA聚合酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策：改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴增。 酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻w系之前用超濾去除酶制劑中的甘油。 IX.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進行PCR擴增時，非特異性擴增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達正常的Tm附近的退火溫度。 X.適當減低的dNTP的濃度，可以分梯度進行。 一般的調(diào)整順序（不是絕對的）：若PCR反應后無任何產(chǎn)物，可先調(diào)整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調(diào)整時從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。同時全部重新配所有的緩沖溶液。 然后調(diào)整引物濃度，在調(diào)整引物與模板的結(jié)合溫度，調(diào)整變性和退火溫度時間。接著或者與引物調(diào)整同時，把酶換成其他類型的DNA聚合酶（高保真酶或者熱啟動酶）。再往后，檢測和重新提取DNA模板（包括用質(zhì)譜或者電泳檢測DNA是否變短，清除酚和SDS，檢測模板濃度，必要時要對DNA模板測序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設計引物了。一般是最先調(diào)整Mg2+ 濃度，最后重新設計引物，其他順序可變。Mg2+ 濃度與dNTP的濃度一般同方向偶聯(lián)調(diào)節(jié)。 XI.適當減少退貨時間和提高退火溫度。 XII.在反應體系中加入：1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率。 過去，我也回答過PCR非特異性擴增的問題，但是這次回答我在2013年8月14日重新編輯核對的。 XIII.使用巢式PCR。 更正:2樓和3樓：調(diào)整鎂離子濃度時，可以與dNTP正相關(guān)的梯度調(diào)整，兩者同方向分梯度調(diào)節(jié)，一般不要反方向調(diào)節(jié)；但是可以單獨鎂離子濃度，而dNTP濃度不動；有時候dNTP濃度調(diào)整不大時也可以不動鎂離子濃度，因為鎂離子濃度太高了，可能會增加非特異性擴增，或者有時候就是可以不動dNTP濃度而只調(diào)節(jié)鎂離子濃度也能夠增加PCR的專一性。 我參考了yujitianqing的帖子，http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 過去我沒有注意到，而后我去查閱了文獻，有的文獻與yujitianqing的帖子的內(nèi)容基本上一致，也有些文獻與yujitianqing的帖子的內(nèi)容并不一致。 |
10樓2014-07-09 02:29:57
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