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那1022銅蟲 (初入文壇)
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細(xì)胞RNA提取一直失敗 ，什么原因？ 已有3人參與
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新手，提取細(xì)胞RNA，連續(xù)幾次都失敗，不知問題出在哪里？ 具體步驟如下： 1） 6孔板，細(xì)胞匯合至90-100%，每孔加入1000ul trizol，反復(fù)吹打，使細(xì)胞溶解，室溫靜置5min。 2）將細(xì)胞的trizol裂解液轉(zhuǎn)移至一1.5mlEP管中，加入200ul的氯仿/1000ul trizol，用手劇烈振搖15s，室溫靜置2－3min，4度 12000 轉(zhuǎn)/分，離心15min。 3）吸取400ul上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入500ul的異丙醇/1000ul trizol，上下?lián)u晃3次，室溫放置10min，4度 12000 轉(zhuǎn)/分離心10min。 4）棄去上清（分別用大小槍頭吸取），沉淀用1ml75％DEPC配制的乙醇溶液洗滌，4度 7500轉(zhuǎn)/分 離心5min， 棄去乙醇溶液，加入20ul 0.1%的DEPC水溶解。 按上述步驟， 連續(xù)幾次提取時(shí)在加入異丙醇離心后都看不到沉淀，用75％乙醇洗滌后才見很小很小的白色沉淀，最終溶解后檢測OD260/OD280基本都在1.6-1.7，電泳跑膠30分鐘，只有加孔樣孔發(fā)亮，或者加樣孔下有很短的彌散。已經(jīng)做了幾次了，都是如此，不知道什么原因，請高手指點(diǎn)。 |
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