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求助，PCR總是P不出條帶�。∏蟠笊� 已有1人參與
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背景-------我是做的野生動(dòng)物微衛(wèi)星遺傳多樣性研究，提取的DNA是從糞便用試劑盒提取的，瓊脂糖電泳條帶都在2000kb以上，且大部分比較亮。引物是從外文文獻(xiàn)上拿來(lái)直接用的。Taq酶，buffer這些也都是新買(mǎi)的，試劑上面應(yīng)該沒(méi)什么問(wèn)題。 PCR體系用12.5微升體系： buffer：1.25 dNTP：1.25 taq酶：0.1 F：1 R：1 DNA：1.5 dd水：6.4 問(wèn)題來(lái)了，用引物1在這個(gè)體系下，用八個(gè)DNA來(lái)分別作溫度梯度PCR，只有一個(gè)DNA能P出來(lái)?xiàng)l帶，且在三個(gè)溫度下都有條帶，然后用另一個(gè)在這個(gè)體系下沒(méi)出條帶的DNA，只是把DNA模板量調(diào)到0.5微升，其他不變，結(jié)果就能P出來(lái)，這就是不是說(shuō)明DNA模板量濃度不同，每個(gè)DNA都要對(duì)應(yīng)一個(gè)需加入的模板量么？？也就是說(shuō)每個(gè)DNA都要對(duì)應(yīng)一個(gè)體系么？？？？ 那么，我的DNA有將近二百個(gè)樣，每個(gè)DNA都要摸索一下要加的模板量的話，還能畢業(yè)么？怎么辦啊？？老師讓我測(cè)一下DNA濃度，大概0.15微克每微升，用同一個(gè)DNA測(cè)兩次的時(shí)候，兩次讀數(shù)相差不小，是儀器的問(wèn)題還是沒(méi)混勻��？應(yīng)該怎么混勻呢，我都是吹打五十次左右的。怎么辦？求大神指點(diǎn)啊。。。。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-06-26 18:21:31
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-06-26 18:21:31
| 不好意思，我估計(jì)幫不上太多忙！只是有點(diǎn)自己的意見(jiàn)，首先，我看你的體系里面忘了寫(xiě)Mg2+了嗎？另外，DNA濃度太大是會(huì)影響PCR效果的，我是做貝類(lèi)的，也是利用微衛(wèi)星分析，我們實(shí)驗(yàn)室一般DNA濃度在20-50ng/ul ，是納克！��！一般是10ul體系放1ul！我有感覺(jué)你的DNA濃度過(guò)大了！在提取DNA后，電泳檢測(cè)后就可以基本確定濃度，沒(méi)有必要說(shuō)一定得精確檢測(cè)！ |
2樓2014-06-26 14:12:02
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