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糾結(jié)中：pcr產(chǎn)物做模板進(jìn)行二次pcr一直失敗，問題詳細(xì)描述，求解。 已有1人參與
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用pcr產(chǎn)物做模板進(jìn)行pcr的時(shí)候總是失敗。如圖所示 本來用基因組做模板，擴(kuò)增的效率很高，如第一張圖，maker與樣都是4微。 由于出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，就用膠回收試劑盒回收了一下，回收結(jié)果如第二張圖，還不錯(cuò)。 為了得到更多的產(chǎn)物，我就用回收產(chǎn)物1微做模板，進(jìn)行pcr。結(jié)果如第三張圖，出現(xiàn)的只是涂抹帶，沒有目的產(chǎn)物。 有人說pcr產(chǎn)物做模板需要稀釋，我就分別進(jìn)行了10倍、50倍、100倍、1000倍和10000倍的稀釋，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的pcr。結(jié)果發(fā)現(xiàn)就50和100倍的可以進(jìn)行低效率的pcr反應(yīng)。如第四張圖所示。但是把循環(huán)數(shù)增加到35個(gè)后，又?jǐn)U增不出產(chǎn)物了。 pcr反應(yīng)用的是takara的LA Taq酶，體系按說明書上的進(jìn)行的（增加了mg+的濃度）25ul的體系，pcr程序是 1、94℃ 1min 2c、98℃ 12sec 3c、58℃ 30sec 4c、68℃ 3min 5、 72℃ 5min 6、 4℃ -：- 循環(huán)數(shù)30和35都試了。 pcr產(chǎn)物膠回收后稀釋前的濃度是29.1ng/ul，稀釋前后都是用1ul做模板。目標(biāo)產(chǎn)物為2.7kb。 我非常迷惑，為什么二次pcr的效率這么低，以及，如何才能提高二次pcr的效率。 請各位pcr高手解答。 2014-5-8 大白麻 南農(nóng)1138 dh2-4 2-4擴(kuò)增.JPG 2014-5-9 大白麻 南農(nóng)1138-2dh2-3 2-4 割膠回收.jpg 2014-5-9 左回收產(chǎn)物pcr.JPG 2014-5-10 大白麻2-3pcr產(chǎn)物做模板濃度梯度試驗(yàn).jpg |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-05-11 08:56:35
283503264: 金幣+20, ★★★很有幫助, 非常感謝 2014-05-11 09:59:28
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建議從基因組上PCR到基因后直接克隆到T載體，先測個(gè)序看看是不是你要的序列再說，如果測序正確直接拿重組T載體做模板就能大規(guī)模PCR，不需要走二次PCR的路線，你二次PCR做不出來我懷疑你從基因組上P到的序列不一定是你想要的，LA是加A酶，如果連不上T載體的話，那PCR產(chǎn)物就很值得懷疑了，你就拿PCR回收的產(chǎn)物直接測序。 二次PCR風(fēng)險(xiǎn)很大，LZ用的LA也不是什么保真酶，反復(fù)PCR很容易導(dǎo)致序列上的點(diǎn)突變，你延伸還3min，30個(gè)循環(huán)PCR至少2——3h，建議二次PCR 25個(gè)循環(huán)就足夠了，時(shí)間再長就不保險(xiǎn)了。 至于LZ的PCR體系，我建議用以下步驟二次PCR試試： 1、94℃ 4min 2c、94℃ 30sec 3c、58℃ 40sec 4c、72℃ 3min 5、 72℃ 10min 6、 4℃ -：- 25個(gè)循環(huán)，模板0.5ul不稀釋，50ul體系試試。 二次PCR的模板反復(fù)凍融后很容易從末端開始掉堿基，也可能導(dǎo)致你P不出來，建議分裝， 二次PCR做檢測還好，大規(guī)模制備基因不建議做二次PCR |
2樓2014-05-11 01:25:23
昨日牛郎
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3樓2014-06-14 15:53:00
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