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SIQING2013新蟲 (初入文壇)
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[求助]
DNA提取總是降解，核酸定量OD比值異常，幫忙分析一下電泳圖 已有3人參與
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提取線蟲DNA，新鮮組織，用液氮研磨成粉狀，然后用稱量勺轉(zhuǎn)移至離心管，然后加入緩沖液DS200ul，混勻，然后加蛋白酶K20ul，55度，2h,然后加裂解液MS 220ul，65度，10min，然后加無水乙醇220ul，轉(zhuǎn)移至純化膜，離心，棄廢液；然后用蛋白漂洗夜PS，漂洗，再用漂洗液PE漂洗兩次，再加入50-80ulTE洗脫。用的是東盛基因組提取試劑盒。電泳圖如下 三哥泳道都點了10ul，樣品1第一泳道核酸定量結(jié)果如下：濃度23.6ng/ul，A260/280:1.68，A260/230: -0.76,A230:-0.620; 樣品2第二泳道核酸定量結(jié)果如下：濃度56.5ng/ul，A260/280：1.8，A260/230：-9.98，A230：-0.113. MARKER用的是takara的15000 ladder,取10ul，每條帶越100ng， 另外，對樣品1和2用Picogreen試劑盒定量結(jié)果顯示，樣品1的濃度為47.67ng/ul, 樣品2的濃度為：73.68ng/ul。注：Picogreen試劑盒為對雙鏈DNA具有特異性結(jié)合的熒光染料定量，可避免RNA,SSDNA的干擾，定量同時做的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.997. 問題：1：從電泳上看，DNA存在降解。我最近連續(xù)提了三個星期了，整個過程也避免漩渦震蕩，基本用手顛倒混勻，還是沒辦法解決，求高手指點。 2：DNA定量感覺都不準(zhǔn)。舉一個例子，從條帶亮度來看，樣品一的亮度不如MARKER亮，但是后面OD值和熒光定量結(jié)果都遠高于100ng,也就是應(yīng)該高于marker的100ng. 不知道熒光定量結(jié)果可不可信。我最終要根據(jù)熒光定量的結(jié)果來進行下一步實驗，很糾結(jié)。 3: 樣品1是被我稀釋了差不多三倍的結(jié)果，之前的亮度跟樣品2相似。在經(jīng)過兩天4度的放置以及稀釋后，拖帶看起來變得沒有那么明顯。在剛剛提出來放置2h后跑過一次電泳，拖帶比這個嚴(yán)重。這個應(yīng)該怎么解釋: 實驗做了快七八九個月了，一點進展都沒有，非常煩惱，跪求各位大俠指點迷津，，，， Image1.jpg |
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9樓2014-06-03 10:19:29
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1.建議樓主在提取的DNA中加入RNA酶，然后在測濃度，RNA會干擾DNA濃度，即使是試劑盒也不行的 2.試驗中的所有離心管和PCR管，研缽都要經(jīng)過高溫高壓滅菌處理 3.試劑盒也有他的缺點，建議用最普通且實用的CTAB法提取，方法如下： （1）取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； （2）加入800 μl的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65℃水浴預(yù)熱），每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000 r/min，離心15 min； （3）小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各400μl）溶液，混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min； （4）小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min。 （5）重復(fù)步驟（4）1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止； （6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，離心10 min； （7）棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次； （8）室溫下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去離子水中，于-20℃或者-70℃下保存?zhèn)溆谩? |
2樓2014-05-27 16:33:54
SIQING2013
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3樓2014-05-27 17:25:15
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