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lixin123qq木蟲 (小有名氣)
小小博士
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[求助]
關(guān)于膜蛋白表達(dá)純化及結(jié)構(gòu)解析的幾個(gè)問題,求解答！ 已有3人參與
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各位學(xué)長前輩你們好，我是天津工生所的學(xué)生，現(xiàn)在在做一個(gè)膜蛋白的表達(dá)純化以及結(jié)構(gòu)解析。由于經(jīng)驗(yàn)不足，遇到各種問題，想請(qǐng)教下各位前輩~~ 我們是采用大腸桿菌C43來對(duì)目的膜蛋白進(jìn)行外源表達(dá)，我選擇的是DDM來溶解細(xì)胞膜并提取膜蛋白（溶膜效果不錯(cuò)）。但是： 1. 在進(jìn)行SDS-PAGE時(shí)，條帶總是彌散狀態(tài)（樣品加入loading buffer后直接上樣電泳，沒有加熱），用同樣的loading buffer跑可溶蛋白，則沒有彌散現(xiàn)象。這是什么原因呢？如何解決？彌散狀態(tài)是否能說明蛋白以不均一狀態(tài)存在？ 2. 我們?cè)诘玫郊兌容^好的蛋白后進(jìn)行hampton screen 試劑盒篩選點(diǎn)晶，發(fā)現(xiàn)有很多條件下長出不很規(guī)則的圓球狀顆粒，用撈晶環(huán)碰觸，其質(zhì)感不像晶體，有種“綿綿”的感覺，請(qǐng)問大家有遇到同樣情況嗎？這種顆粒是什么呢？是detergent？什么原因?qū)е逻@種顆粒的形成呢？ 3. 我手上還有另外一個(gè)膜蛋白，也是用DDM進(jìn)行溶膜提取，Ni柱純化后，4度放置一天則會(huì)發(fā)現(xiàn)其溶液呈煙霧狀，這應(yīng)該是蛋白不穩(wěn)定導(dǎo)致的，遇到這種情況我該從哪些方面進(jìn)行改善呢？ 課題糾纏于這些問題不得進(jìn)展，很是痛苦，希望各位前輩不吝賜教，不勝感激！ 膜蛋白SDS-PAGE.jpg 球狀顆粒.jpg |
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5樓2018-08-06 21:00:47
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