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海棠依舊磊新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
從轉(zhuǎn)錄組中找到感興趣的基因進(jìn)行克隆表達(dá) 已有1人參與
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想從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到感興趣的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，找到基因后在NCBI上BLAST發(fā)現(xiàn)和同源物種的基因相似性很高（80%左右），片段長(zhǎng)度也差不多（2000bp左右），接下來(lái)想分析該基因的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行各組織的定量qtPCR等實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)問(wèn)下還需要重新擴(kuò)增該基因嗎？？？還是直接使用轉(zhuǎn)錄組的序列設(shè)計(jì)定量引物呢？？ 剛接觸這方面的知識(shí)，都不太懂。。。個(gè)人感覺(jué)需要重新擴(kuò)增，因?yàn)樗瞧唇悠饋?lái)的，可能他的長(zhǎng)度和我重新擴(kuò)增的長(zhǎng)度會(huì)有較大的區(qū)別。？但是問(wèn)了一些師兄師姐，說(shuō)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)相對(duì)來(lái)言比較準(zhǔn)確，不需要擴(kuò)增可以直接使用。但是到時(shí)寫(xiě)文章的時(shí)候該怎么說(shuō)明基因的來(lái)源呢？？？我看到有些SCI中會(huì)說(shuō)先測(cè)序，后建立BAC文庫(kù)，然后在使用基因進(jìn)行分析。？不太懂。。。。 |
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海棠依舊磊
新蟲(chóng) (初入文壇)
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2樓2014-07-14 18:03:01
【答案】應(yīng)助回帖
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海棠依舊磊(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-15 18:54:06
海棠依舊磊: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 現(xiàn)在自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物重新擴(kuò)增，由于ORF有1800bp左右，所以設(shè)計(jì)了幾對(duì)1200-2000bp的引物，可是都沒(méi)有跑出目的條帶啊。。。不知道是什么原因？？？所以準(zhǔn)備分段進(jìn)行設(shè)計(jì)引物再看看。。。 2014-07-19 19:17:21
海棠依舊磊(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-15 18:54:06
海棠依舊磊: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 現(xiàn)在自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物重新擴(kuò)增，由于ORF有1800bp左右，所以設(shè)計(jì)了幾對(duì)1200-2000bp的引物，可是都沒(méi)有跑出目的條帶啊。。。不知道是什么原因？？？所以準(zhǔn)備分段進(jìn)行設(shè)計(jì)引物再看看。。。 2014-07-19 19:17:21
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你說(shuō)的不太清楚，我想大概分兩種情況： 1：用提取dna重新擴(kuò)增，長(zhǎng)度比測(cè)序的長(zhǎng)；2：用提取的rna反轉(zhuǎn)的cdna重新擴(kuò)增比測(cè)序的片段長(zhǎng)； 如果是1，那是正常的，轉(zhuǎn)錄組的測(cè)的就是rna反轉(zhuǎn)的cdna，測(cè)序片段是不含內(nèi)含子的，這就是為什么你重新擴(kuò)增比你的測(cè)序片段長(zhǎng)。 如果是2，也是正常的，因?yàn)闇y(cè)序結(jié)果還需要進(jìn)行拼接，在我們的測(cè)序得到的unigene中，有g(shù)ap的，這就導(dǎo)致你重新擴(kuò)增的結(jié)果和測(cè)序的結(jié)果可能不一致。 最好自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，自己重新擴(kuò)增，這樣就是最準(zhǔn)的。但大體上不會(huì)和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果有什么出入。 |
3樓2014-07-15 13:41:01
llyman
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4樓2014-07-17 11:00:56
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llyman
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6樓2014-07-17 17:08:47
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