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從轉(zhuǎn)錄組中找到感興趣的基因進行克隆表達 已有1人參與
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想從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到感興趣的基因進行克隆表達，找到基因后在NCBI上BLAST發(fā)現(xiàn)和同源物種的基因相似性很高（80%左右），片段長度也差不多（2000bp左右），接下來想分析該基因的結(jié)構(gòu)，進行各組織的定量qtPCR等實驗，請問下還需要重新擴增該基因嗎？？？還是直接使用轉(zhuǎn)錄組的序列設(shè)計定量引物呢？？ 剛接觸這方面的知識，都不太懂。。。個人感覺需要重新擴增，因為他是拼接起來的，可能他的長度和我重新擴增的長度會有較大的區(qū)別。？但是問了一些師兄師姐，說轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)相對來言比較準確，不需要擴增可以直接使用。但是到時寫文章的時候該怎么說明基因的來源呢？？？我看到有些SCI中會說先測序，后建立BAC文庫，然后在使用基因進行分析。？不太懂。。。。 |
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llyman
銀蟲 (小有名氣)
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4樓2014-07-17 11:00:56
2樓2014-07-14 18:03:01
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
海棠依舊磊(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-15 18:54:06
海棠依舊磊: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 現(xiàn)在自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計引物重新擴增，由于ORF有1800bp左右，所以設(shè)計了幾對1200-2000bp的引物，可是都沒有跑出目的條帶啊。。。不知道是什么原因？？？所以準備分段進行設(shè)計引物再看看。。。 2014-07-19 19:17:21
海棠依舊磊(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-15 18:54:06
海棠依舊磊: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 現(xiàn)在自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計引物重新擴增，由于ORF有1800bp左右，所以設(shè)計了幾對1200-2000bp的引物，可是都沒有跑出目的條帶啊。。。不知道是什么原因？？？所以準備分段進行設(shè)計引物再看看。。。 2014-07-19 19:17:21
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你說的不太清楚，我想大概分兩種情況： 1：用提取dna重新擴增，長度比測序的長；2：用提取的rna反轉(zhuǎn)的cdna重新擴增比測序的片段長； 如果是1，那是正常的，轉(zhuǎn)錄組的測的就是rna反轉(zhuǎn)的cdna，測序片段是不含內(nèi)含子的，這就是為什么你重新擴增比你的測序片段長。 如果是2，也是正常的，因為測序結(jié)果還需要進行拼接，在我們的測序得到的unigene中，有g(shù)ap的，這就導致你重新擴增的結(jié)果和測序的結(jié)果可能不一致。 最好自己提rna反轉(zhuǎn)cdna后，自己重新擴增，這樣就是最準的。但大體上不會和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果有什么出入。 |
3樓2014-07-15 13:41:01
5樓2014-07-17 13:55:01
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