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喜氣洋洋金蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
Taq和KOD酶使用討論 已有5人參與
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做定點(diǎn)突變PCR，擴(kuò)增6千多b的片段，前三次用的Taq酶，擴(kuò)增后可以看到條帶，且進(jìn)行了膠回收，測(cè)的DNA濃度有17.2ng/ul，用Dpn1酶切后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)。然后涂板，沒(méi)有長(zhǎng)斑，以為是濃度不夠的問(wèn)題，后面特意在濃度上做了富集，都沒(méi)長(zhǎng)。第四次選用了KOD酶，今天早上過(guò)來(lái)一看，有斑了。想了半天為什么，現(xiàn)在有兩個(gè)可能，在此和同在做的小伙伴們交流一下，希望前輩們給予指導(dǎo)。首先，是不是因?yàn)門aq酶有在末端加上A的原因，影響了擴(kuò)增片段粘性末端的環(huán)化連接。第二，是不是Taq酶不能擴(kuò)增好6kb以上的片段，但是為什么有出現(xiàn)了目標(biāo)大小的片段呢？第三，如果是濃度問(wèn)題，我在第二次時(shí)，特意將循環(huán)加到了35個(gè)，后面涂板時(shí)還先富集濃縮后，再涂的。結(jié)果仍然是什么都沒(méi)長(zhǎng)。 雖然實(shí)驗(yàn)做過(guò)去了，但是還想回過(guò)頭來(lái)問(wèn)問(wèn)失敗的原因，不想讓自己的埋頭實(shí)驗(yàn)變成無(wú)用功。希望，同行們看帖后也幫我想想，一起交流成長(zhǎng)。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-13 19:22:28
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-13 19:22:28
| 我做點(diǎn)突變都是用的KOD，沒(méi)試過(guò)Taq。雖然也有一些報(bào)道直接用Taq或Taq plus做點(diǎn)突變，但我認(rèn)為存在一些潛在的問(wèn)題，首先，普通Taq酶錯(cuò)配率相對(duì)較高，不如KOD等高保真酶。其次，普通Taq不是很適用于大片段擴(kuò)增，我懷疑樓主看到的大小差不多的片段，恐怕具體序列也有問(wèn)題，如果想探究，不妨把該條帶回收送去測(cè)測(cè)序，看看3‘末端是什么樣的。第三，Taq酶在末端加A，有可能造成移碼突變。 |
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喜氣洋洋3樓2014-07-13 16:15:16
喜氣洋洋
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