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喜氣洋洋金蟲 (初入文壇)
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[交流]
Taq和KOD酶使用討論 已有5人參與
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做定點突變PCR，擴增6千多b的片段，前三次用的Taq酶，擴增后可以看到條帶，且進行了膠回收，測的DNA濃度有17.2ng/ul，用Dpn1酶切后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)。然后涂板，沒有長斑，以為是濃度不夠的問題，后面特意在濃度上做了富集，都沒長。第四次選用了KOD酶，今天早上過來一看，有斑了。想了半天為什么，現(xiàn)在有兩個可能，在此和同在做的小伙伴們交流一下，希望前輩們給予指導。首先，是不是因為Taq酶有在末端加上A的原因，影響了擴增片段粘性末端的環(huán)化連接。第二，是不是Taq酶不能擴增好6kb以上的片段，但是為什么有出現(xiàn)了目標大小的片段呢？第三，如果是濃度問題，我在第二次時，特意將循環(huán)加到了35個，后面涂板時還先富集濃縮后，再涂的。結(jié)果仍然是什么都沒長。 雖然實驗做過去了，但是還想回過頭來問問失敗的原因，不想讓自己的埋頭實驗變成無用功。希望，同行們看帖后也幫我想想，一起交流成長。 [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-13 19:22:28
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-13 19:22:28
| 我做點突變都是用的KOD，沒試過Taq。雖然也有一些報道直接用Taq或Taq plus做點突變，但我認為存在一些潛在的問題，首先，普通Taq酶錯配率相對較高，不如KOD等高保真酶。其次，普通Taq不是很適用于大片段擴增，我懷疑樓主看到的大小差不多的片段，恐怕具體序列也有問題，如果想探究，不妨把該條帶回收送去測測序，看看3‘末端是什么樣的。第三，Taq酶在末端加A，有可能造成移碼突變。 |
喜氣洋洋3樓2014-07-13 16:15:16
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5樓2014-07-13 23:02:58
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