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biology-girl新蟲 (正式寫手)
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RNA 反轉(zhuǎn)錄后依然有內(nèi)含子序列？ 已有3人參與
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| 如題，最近克隆一個(gè)基因，但是有內(nèi)含子，遂提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄，可是測序結(jié)果回來后發(fā)現(xiàn)還是有內(nèi)含子序列。請問各位大俠 設(shè)施怎么回事？ 是我的方法操作有問題？還是NCBI 上公布的有問題（此基因以前沒人克隆過） PS：沒人克隆過那個(gè)基因，那NCBI 上的CDS 區(qū) 是怎么得來的？ 是不是NCBI上的不對呀？ |
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luwei13566
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gyesang: 回帖置頂 2014-07-27 20:59:55
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1.你的基因上應(yīng)該不止一個(gè)內(nèi)含子吧。你提出來的RNA是只保留了其中的幾個(gè)內(nèi)含子還是所有的內(nèi)含子全部存在？如果內(nèi)含子全部存在我就有理由懷疑你的RNA中是否有基因組的污染。你首先需要排除這個(gè)可能 2.如果只是一部分內(nèi)含子存在那你得排除沒有正常剪切這種情況。你說的挑了十幾個(gè)重組菌提了質(zhì)粒后測序是在一個(gè)平板上長的轉(zhuǎn)化子嗎？你的平板上長了有多少個(gè)轉(zhuǎn)化子？你這種情況挑十幾個(gè)還是太少了。要有說服力至少得挑50個(gè)—100個(gè)吧。然后算一個(gè)你這種帶內(nèi)含子的比例，另外你還得再提一次RNA重復(fù)1—2次試驗(yàn)。一般不充分的剪切和你的培養(yǎng)條件還是有關(guān)系的，如果可以的話試著換一下培養(yǎng)條件試試。 3.如果把不正常剪切這種情況排除，證明你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是合理的。那你下一步還需要嘗試質(zhì)疑NCBI上已提交序列的合理性，首先就是功能對比驗(yàn)證，用融合PCR除去那個(gè)內(nèi)含子得到和NCBI上一致的基因作為你的這個(gè)帶內(nèi)含子基因的對照，之后一起表達(dá)蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證，如果你的基因有功能而網(wǎng)上的基因沒功能，那你就有推翻NCBI上那個(gè)序列的證據(jù)了。如果兩個(gè)蛋白都有功能但是有差異的話，這就是個(gè)更有意思的結(jié)論了，從這個(gè)結(jié)果又可以延伸出一個(gè)課題。如果你不做功能的話，可以用個(gè)定量PCR從轉(zhuǎn)錄水平去驗(yàn)證。你想推翻現(xiàn)在已有的結(jié)果就必須拿出有力的證據(jù)。 4.你的這個(gè)結(jié)果只要證據(jù)充分而且你研究的這個(gè)基因的意義明顯一篇高分SCI是跑不了的，如果只是提個(gè)RNA，測個(gè)序列算個(gè)比例的話，sci很困難。 |
6樓2014-07-19 13:12:55
2樓2014-07-19 09:21:52
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-20 21:24:39
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1.有沒有污染先看你的測序結(jié)果，你的基因有幾個(gè)內(nèi)含子？而你的測序結(jié)果又保留了幾個(gè)內(nèi)含子？如果你的基因里包含了NCBI上所預(yù)測的所有內(nèi)含子那基因組污染的可能性非常大。如果只包含一個(gè)或一部分內(nèi)含子，那基因組污染的可能性就已經(jīng)排除了。瓊脂糖膠是有個(gè)分辨率的，你肉眼看不到并不代表就沒有。 2.你RT-PCR做完是連T載體嗎？怎么快100個(gè)轉(zhuǎn)化子里才這么點(diǎn)陽性，你用的是什么taq酶，連接體系是多少？基因與載體摩爾比又是多少？盡管你是分幾次做的。但是你的陽性太少就沒法排除偶然的錯(cuò)誤剪切導(dǎo)致的mRNA前體的可能性。 |
9樓2014-07-20 14:26:53
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10樓2014-07-21 09:21:07
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