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胡曉鳳銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
Bgl2和Hind3雙酶切切不開 已有4人參與
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各位大俠： 我用Bgl2和Hind3雙酶切酶切我的重組質(zhì)粒只能切除一條8000bp左右的條帶（正確的應(yīng)該是一條1700bp，一條6300bp），但是分別用這兩個(gè)酶單酶切也能切出同樣大小的條帶，之后我用Bgl2酶切后回收再用Hind3酶切，還是切出同樣大小的條帶。我需要回收我雙酶切之后其中的一個(gè)片段，請(qǐng)問(wèn)我應(yīng)該怎么做？ |
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luwei13566
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:41
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:41
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LZ你的載體提質(zhì)粒的時(shí)候能看到超螺旋吧，而且你的這兩個(gè)酶的識(shí)別位點(diǎn)在基因的兩側(cè)對(duì)吧，如果有超螺旋單酶切都能把載體線性化說(shuō)明酶本身沒(méi)問(wèn)題而且載體上有識(shí)別位點(diǎn)，但是好像兩個(gè)酶放一塊就只有一個(gè)酶起作用。 1.一種可能是你的兩個(gè)酶的酶切buffer是不是不兼容導(dǎo)致雙酶切一個(gè)酶不起作用，你的內(nèi)切酶是哪個(gè)公司的酶？LZ你后期做了分步酶切是如何做的？ 2.另一種可能是你基因一側(cè)的酶的酶切位點(diǎn)沒(méi)有用，假設(shè)你基因一端的酶切位點(diǎn)BglII因?yàn)橥蛔兪Я�，而在HandIII的酶切位點(diǎn)很近的地方存在另一個(gè)BglII的酶切位點(diǎn)，這樣兩個(gè)單酶切都能切出來(lái)一條帶，而雙酶切切出了一條近似于你質(zhì)粒長(zhǎng)度的條帶和一條很小的條帶，就跟做雙酶切空載體把兩酶切位點(diǎn)間的MCS切掉一樣，電泳也檢測(cè)不出來(lái)那個(gè)小的，而你雙酶切和分步酶切的結(jié)果也給人一種只有一個(gè)酶起作用的假象。 這兩個(gè)內(nèi)切酶都不受甲基化影響，后一種可能性比較大，所以你這種情況必須測(cè)序驗(yàn)證一下，另外篩查一下你重組質(zhì)粒這兩個(gè)酶切位點(diǎn)外側(cè)的載體序列上是否有另一個(gè)酶切位點(diǎn) |
胡曉鳳
4樓2014-07-21 23:37:58
胡曉鳳
銀蟲 (小有名氣)
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2樓2014-07-21 20:49:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:35
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:35
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首先確認(rèn)兩個(gè)酶切位點(diǎn)都在： 1）可以測(cè)序分析（最穩(wěn)妥） 2）也可以進(jìn)行單切分析，但前提是你的質(zhì)粒的質(zhì)量比較好（未酶切的質(zhì)粒以超螺旋為主，其電泳位置與單切后線性化質(zhì)粒的位置明顯不同），電泳時(shí)以未酶切的質(zhì)粒為對(duì)照，以判斷單酶切是否成功，進(jìn)而判斷酶切位點(diǎn)是否正常 |
3樓2014-07-21 22:08:44
【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:45
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樓主給的信息太少，如果能夠把質(zhì)粒圖譜放上來(lái)可能會(huì)更容易參考，知道具體的酶切位點(diǎn)數(shù)量和位置更容易判斷問(wèn)題在哪兒。 1. 有可能質(zhì)粒重組使得你的酶切位點(diǎn)產(chǎn)生了移位，最好的辦法是測(cè)序。如果質(zhì)粒較大，起碼把這兩個(gè)酶切位點(diǎn)檢測(cè)一下 2.單切沒(méi)問(wèn)題的話，檢查一下你雙切時(shí)候用的Buffer是否是兩個(gè)酶都有100%活性的。 3.有可能其中一個(gè)位點(diǎn)（把8k切成1.7k和6.3k的那個(gè)位點(diǎn)）已經(jīng)突變消失，或者是移位到另一個(gè)位點(diǎn)的附近，所以當(dāng)再切的時(shí)候只能切出一個(gè)很小的片段，留下的片段與8k相近。同樣需要用測(cè)序來(lái)確認(rèn)。 |
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5樓2014-07-22 03:09:08
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