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胡曉鳳銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
Bgl2和Hind3雙酶切切不開 已有4人參與
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各位大俠： 我用Bgl2和Hind3雙酶切酶切我的重組質(zhì)粒只能切除一條8000bp左右的條帶（正確的應該是一條1700bp，一條6300bp），但是分別用這兩個酶單酶切也能切出同樣大小的條帶，之后我用Bgl2酶切后回收再用Hind3酶切，還是切出同樣大小的條帶。我需要回收我雙酶切之后其中的一個片段，請問我應該怎么做？ |
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luwei13566
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-22 08:34:41
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-22 08:34:41
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LZ你的載體提質(zhì)粒的時候能看到超螺旋吧，而且你的這兩個酶的識別位點在基因的兩側(cè)對吧，如果有超螺旋單酶切都能把載體線性化說明酶本身沒問題而且載體上有識別位點，但是好像兩個酶放一塊就只有一個酶起作用。 1.一種可能是你的兩個酶的酶切buffer是不是不兼容導致雙酶切一個酶不起作用，你的內(nèi)切酶是哪個公司的酶？LZ你后期做了分步酶切是如何做的？ 2.另一種可能是你基因一側(cè)的酶的酶切位點沒有用，假設你基因一端的酶切位點BglII因為突變失效了，而在HandIII的酶切位點很近的地方存在另一個BglII的酶切位點，這樣兩個單酶切都能切出來一條帶，而雙酶切切出了一條近似于你質(zhì)粒長度的條帶和一條很小的條帶，就跟做雙酶切空載體把兩酶切位點間的MCS切掉一樣，電泳也檢測不出來那個小的，而你雙酶切和分步酶切的結(jié)果也給人一種只有一個酶起作用的假象。 這兩個內(nèi)切酶都不受甲基化影響，后一種可能性比較大，所以你這種情況必須測序驗證一下，另外篩查一下你重組質(zhì)粒這兩個酶切位點外側(cè)的載體序列上是否有另一個酶切位點 |
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胡曉鳳
4樓2014-07-21 23:37:58
胡曉鳳
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2樓2014-07-21 20:49:04
panda73
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3樓2014-07-21 22:08:44
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-22 08:34:45
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-22 08:34:45
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樓主給的信息太少，如果能夠把質(zhì)粒圖譜放上來可能會更容易參考，知道具體的酶切位點數(shù)量和位置更容易判斷問題在哪兒。 1. 有可能質(zhì)粒重組使得你的酶切位點產(chǎn)生了移位，最好的辦法是測序。如果質(zhì)粒較大，起碼把這兩個酶切位點檢測一下 2.單切沒問題的話，檢查一下你雙切時候用的Buffer是否是兩個酶都有100%活性的。 3.有可能其中一個位點（把8k切成1.7k和6.3k的那個位點）已經(jīng)突變消失，或者是移位到另一個位點的附近，所以當再切的時候只能切出一個很小的片段，留下的片段與8k相近。同樣需要用測序來確認。 |
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5樓2014-07-22 03:09:08
胡曉鳳
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6樓2014-07-22 11:35:05
胡曉鳳
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7樓2014-07-22 11:45:42
luwei13566
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8樓2014-07-22 16:22:02
【答案】應助回帖
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胡曉鳳(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-22 20:46:50
胡曉鳳(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-07-22 20:46:50
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1. 你的測序是在提質(zhì)粒做酶切之前還是之后？就是說測序之后你是直接做酶切還是做了菌轉(zhuǎn)化、提質(zhì)粒再酶切的。如果是后者，有可能是在轉(zhuǎn)化時發(fā)生重組，雖然可能性很小。最好把你用于酶切的質(zhì)粒也做一下測序，只需要測HindIII-BglII這個區(qū)間就好。 2.如果測序沒有問題，那么問題就出在酶切上�？茨阒罢f的，兩個酶的工作Buffer并不一樣。單切沒問題，說明酶和Buffer都沒問題。你做分別單切的時候有電泳圖么？最好跑一個膠，同時跑單、雙切以及未切質(zhì)粒，發(fā)上來參考一下。 3.在分次單切的時候，其實沒有必要做切膠提質(zhì)粒。個人覺得切膠提質(zhì)粒的純度和回收量并不好，有可能影響后續(xù)。你第一次單切后完全可以用PCR提純柱。反正你切完第二次之后還是要切膠的，能少一次損耗是一次。 |
9樓2014-07-22 18:32:42
10樓2014-07-22 23:16:12
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