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胡曉鳳銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
Bgl2和Hind3雙酶切切不開 已有4人參與
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各位大俠： 我用Bgl2和Hind3雙酶切酶切我的重組質(zhì)粒只能切除一條8000bp左右的條帶（正確的應(yīng)該是一條1700bp，一條6300bp），但是分別用這兩個(gè)酶單酶切也能切出同樣大小的條帶，之后我用Bgl2酶切后回收再用Hind3酶切，還是切出同樣大小的條帶。我需要回收我雙酶切之后其中的一個(gè)片段，請(qǐng)問我應(yīng)該怎么做？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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胡曉鳳(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-22 20:46:50
胡曉鳳(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-22 20:46:50
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1. 你的測(cè)序是在提質(zhì)粒做酶切之前還是之后？就是說測(cè)序之后你是直接做酶切還是做了菌轉(zhuǎn)化、提質(zhì)粒再酶切的。如果是后者，有可能是在轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)生重組，雖然可能性很小。最好把你用于酶切的質(zhì)粒也做一下測(cè)序，只需要測(cè)HindIII-BglII這個(gè)區(qū)間就好。 2.如果測(cè)序沒有問題，那么問題就出在酶切上�？茨阒罢f的，兩個(gè)酶的工作Buffer并不一樣。單切沒問題，說明酶和Buffer都沒問題。你做分別單切的時(shí)候有電泳圖么？最好跑一個(gè)膠，同時(shí)跑單、雙切以及未切質(zhì)粒，發(fā)上來參考一下。 3.在分次單切的時(shí)候，其實(shí)沒有必要做切膠提質(zhì)粒。個(gè)人覺得切膠提質(zhì)粒的純度和回收量并不好，有可能影響后續(xù)。你第一次單切后完全可以用PCR提純柱。反正你切完第二次之后還是要切膠的，能少一次損耗是一次。 |
9樓2014-07-22 18:32:42
胡曉鳳
銀蟲 (小有名氣)
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2樓2014-07-21 20:49:04
panda73
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:35
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:35
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首先確認(rèn)兩個(gè)酶切位點(diǎn)都在： 1）可以測(cè)序分析（最穩(wěn)妥） 2）也可以進(jìn)行單切分析，但前提是你的質(zhì)粒的質(zhì)量比較好（未酶切的質(zhì)粒以超螺旋為主，其電泳位置與單切后線性化質(zhì)粒的位置明顯不同），電泳時(shí)以未酶切的質(zhì)粒為對(duì)照，以判斷單酶切是否成功，進(jìn)而判斷酶切位點(diǎn)是否正常 |
3樓2014-07-21 22:08:44
luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:41
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-22 08:34:41
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LZ你的載體提質(zhì)粒的時(shí)候能看到超螺旋吧，而且你的這兩個(gè)酶的識(shí)別位點(diǎn)在基因的兩側(cè)對(duì)吧，如果有超螺旋單酶切都能把載體線性化說明酶本身沒問題而且載體上有識(shí)別位點(diǎn)，但是好像兩個(gè)酶放一塊就只有一個(gè)酶起作用。 1.一種可能是你的兩個(gè)酶的酶切buffer是不是不兼容導(dǎo)致雙酶切一個(gè)酶不起作用，你的內(nèi)切酶是哪個(gè)公司的酶？LZ你后期做了分步酶切是如何做的？ 2.另一種可能是你基因一側(cè)的酶的酶切位點(diǎn)沒有用，假設(shè)你基因一端的酶切位點(diǎn)BglII因?yàn)橥蛔兪Я耍贖andIII的酶切位點(diǎn)很近的地方存在另一個(gè)BglII的酶切位點(diǎn)，這樣兩個(gè)單酶切都能切出來一條帶，而雙酶切切出了一條近似于你質(zhì)粒長度的條帶和一條很小的條帶，就跟做雙酶切空載體把兩酶切位點(diǎn)間的MCS切掉一樣，電泳也檢測(cè)不出來那個(gè)小的，而你雙酶切和分步酶切的結(jié)果也給人一種只有一個(gè)酶起作用的假象。 這兩個(gè)內(nèi)切酶都不受甲基化影響，后一種可能性比較大，所以你這種情況必須測(cè)序驗(yàn)證一下，另外篩查一下你重組質(zhì)粒這兩個(gè)酶切位點(diǎn)外側(cè)的載體序列上是否有另一個(gè)酶切位點(diǎn) |
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胡曉鳳4樓2014-07-21 23:37:58
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