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[求助] cDNA為模板擴增目的片段，條帶大部分都很淡，不亮的原因是什么啊已有1人參與

各位大神，請問，實驗中提取的RNA做反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA為模板擴增目的基因，開始按照說明書做了幾次，包括內(nèi)參在內(nèi)的條帶都很淡，但是UFGT的比較亮，然后又試驗了一次，把酶的量和模板的量都加了一倍，我是TAKARA的taq酶，50uL的體系，然后內(nèi)參突然變得比UFGT的亮了，其他條帶還是不怎么亮，除了ppo和POD那么淡的，別的一些的亮度是不是也不能夠用來做實時定量啊？為什么條帶會這么暗呢？話說50ul的體系都這么暗的話，做實時定量的時候，體系更小，不是更暗嗎？

20140912-目的基因.jpg

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1樓 2014-09-15 14:45:43

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fuchange918

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foodwl: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-09-24 20:41:58

樓主每對引物的最佳退火溫度都確定嗎？調(diào)一下退火溫度試試。跟我們實驗室做的好像阿，全是花青苷方面的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因

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2樓2014-09-15 14:54:35

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一個可能因為你的RNA模板是不是有降解，第二個，可能這些基因的表達(dá)量在你提取RNA模板中表達(dá)量本身就比較低。

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3樓2014-09-15 14:56:04

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3樓: Originally posted by 我欲乘風(fēng)歸去 at 2014-09-15 14:56:04
一個可能因為你的RNA模板是不是有降解，第二個，可能這些基因的表達(dá)量在你提取RNA模板中表達(dá)量本身就比較低。

還有一個看看你的引物設(shè)計的怎么樣了

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4樓2014-09-15 14:56:57

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2樓: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-15 14:54:35
樓主每對引物的最佳退火溫度都確定嗎？調(diào)一下退火溫度試試。跟我們實驗室做的好像阿，全是花青苷方面的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因

好厲害，被看穿了~~嘿嘿

加上內(nèi)參，我一共有10個基因，因為最后要做實時定量，到時候說儀器的溫度是只有一個，一般就用55℃的啊，所以我就統(tǒng)一用的是55℃作為退火溫度，怕萬一到時候退火溫度限制了，跑出來不一樣怎么辦呢？每對因為的退火溫度都不一樣呢。。。像這樣退火溫度怎么統(tǒng)一呢？

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5樓2014-09-15 16:31:14

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4樓: Originally posted by 我欲乘風(fēng)歸去 at 2014-09-15 14:56:57
還有一個看看你的引物設(shè)計的怎么樣了...

謝謝你哈，這個應(yīng)該有很大的可能，這上面的都是我第一次設(shè)計的引物，用的primer5，只知道在里面的評分是高的，然后沒有錯配，沒有別的什么問題，還有一個問題是，之前DNR、CHS的一對引物跑過一次還是很亮的，這一次的這兩個也暗了

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6樓2014-09-15 16:34:49

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4樓: Originally posted by 我欲乘風(fēng)歸去 at 2014-09-15 14:56:57
還有一個看看你的引物設(shè)計的怎么樣了...

謝謝你，就是RNA降解的可能應(yīng)該可以排出，就是我們是做采后的，有可能是表達(dá)量本身比較低，那如果這樣的話，做實時定量的時候該怎么辦呀?

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7樓2014-09-15 16:37:05

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7樓: Originally posted by foodwl at 2014-09-15 16:37:05
謝謝你，就是RNA降解的可能應(yīng)該可以排出，就是我們是做采后的，有可能是表達(dá)量本身比較低，那如果這樣的話，做實時定量的時候該怎么辦呀?...

就這么做，本身表達(dá)量低沒辦法。你看下人家的文獻(xiàn)做過類似的基因在其他物種的表達(dá)分析沒有，看下你做的是不是和別人的一致。

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8樓2014-09-29 16:33:24

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樓主，你好，我想咨詢你點問題，我想做一些不同干旱條件下基因表達(dá)的差異，以前從來沒做過，想知道把RNA提取出來后從mRNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所需引物怎么設(shè)計？我只是想做出一些不同干旱條件下在跑大板時條帶數(shù)量上的差異，并不想再深入下去測序啥的？希望樓主可以給些建議，謝謝！還有就是想問一下哪些單位對外做這些工作？我想把樣送出去做！

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9樓2015-07-03 22:20:10

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10樓2015-07-04 16:43:50

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