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熔解曲線單峰，但電泳卻發(fā)現(xiàn)除目的條帶外的非特異擴增帶（亦非引物二聚體） 已有1人參與
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骨髓瘤細(xì)胞系，目的基因MDM4-FL 反應(yīng)體系： 正反引物各0.65 ul（濃度為0.3uM） 模板cDNA 7.6ul（TAKARA PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)后，-10×稀釋 ） PCR MIX 12.4ul（ROCHE FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)） 反應(yīng)程序： 預(yù)變性 95度 10min 變性 95度 10s 退火/延伸 58度 20s，40 cycles 熔解曲線為單峰，但電泳卻能發(fā)現(xiàn)極少的非特異擴增條帶（約500-700bp左右）。剛開始，我使用的退火溫度為56度，該條帶明顯。58度仍然可見很少量的非特異條帶。60度反而更明顯（圖3），最后將退火溫度提高到62度，仍然存在。但不管什么溫度，溶解曲線都是類似（圖1）的單峰。此后，通過減少循環(huán)（從40降至35，）才基本消失（圖2）。 marker從下往上，依次為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500。 12%聚丙烯凝膠電泳。第3張電泳上樣量分5ul、10ul。第2張電泳上樣量5ul。第一張熔解曲線與第二張圖是同一次擴增， 請問： 這樣的熔解曲線能認(rèn)定為單峰嗎？ 為何熔解曲線和電泳結(jié)果不一致呢？不是說熔解曲線更為敏感嗎？ 第4張圖，提高退火溫度（其他都沒有變）后，為何非特異條帶反而更濃？謝謝 MDM4-FL 熔解.png 電泳.jpg 10-5 MDM4-FL 56 58 60原圖.jpg |
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3樓2014-10-08 16:22:43
xfflying1
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 185
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- 蟲號: 2453979
- 注冊: 2013-05-08
- 專業(yè): 植物遺傳學(xué)
2樓2014-10-08 15:48:34
4樓2014-10-09 12:53:18
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