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溶解曲線不好熒光定量pcr的數據就用不了嗎？ 已有6人參與
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以PCR產物純化后為模板進行熒光定量PCR，目的基因nxrB，如圖 1溶解曲線的這兩個雜峰第一個是二聚體第二個是非特異性擴增是嗎？ 2我退火溫度從55提高一直到這次的63度，引物濃度也減半了（到5uM)可二聚體還是存在，這種情況該怎么優(yōu)化實驗條件？ 3引物序列是根據文獻上應該說比較成熟了的來合成的，看到些帖子說是污染了，在不重提DNA前提下有哪些地方可以優(yōu)化的呢？ 4擴增曲線看還是可以的，但是不是溶解曲線不好數據就完全用不了啊？ |
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 QPCR 問題簡答 |
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冷雁孤旅
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2014-08-20 16:56:40
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2014-08-20 16:56:40
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你的圖是有引物二聚體以及非特異信不過擴增。 解決方案： 1.減少酶的用量。 2.稀釋引物濃度，我使用的是200mM.你的濃度太大引物的，你看看你的SYBR I 要求的最佳濃度時多少。 （以上2個步驟可以按照普通PCR來進行摸索 優(yōu)化條件以后在上熒光 這樣節(jié)約試劑） 3.重新設計引物（最根本的方法） 4.稀釋模板濃度，我一般吧普通PCR的產物取用稀釋10-3次方到10-7次方來做。 4.有可能是有分子污染，建議配試劑和加樣在不同房間進行，一次加樣一個槍頭，操作間要是沒條件的話，你可以使用大量酒精噴工作臺，搽干凈桌面�；蛘呤怯么罅克疀_洗工作臺。并且QPCR產物不要亂扔，盡量丟遠點，我一般丟在其他實驗室操作間以外的的垃圾桶。希望對你有用 手打 不容易 祝順利 |
8樓2014-08-08 17:47:21
空谷幽風
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