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強(qiáng)疏水性蛋白跑非變性蛋白電泳不易進(jìn)膠 已有2人參與
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| 目標(biāo)蛋白來(lái)源是細(xì)菌，菌體破碎高速離心得到粗提液。在用粗提液做疏水作用色譜時(shí)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白疏水性很強(qiáng)，洗脫時(shí)20mM的Tris都不能將明白蛋白洗脫下來(lái)，需要用超純水才可以。將疏水作用色譜純化用超純水洗脫下來(lái)的包含木蛋白的部分收集，超濾濃縮到1mL左右。由于疏水色譜純化的洗脫液幾乎全是超純水，所以添加20mM Tris（pH9.0），20mM NaCl，5%甘油，1mM PMSF（異丙醇溶解的100mM濃度的母液）。冰上平衡10分鐘后上樣做非變性蛋白電泳。蛋白電泳用37.5:1比例的膠配置，pH9.0。上層膠濃度為4%，下層膠濃度為6%。電泳初始20分鐘電泳為100V，之后電泳為300V，持續(xù)2h。電泳結(jié)束后，根據(jù)目標(biāo)蛋白活性染色，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白停留在上樣槽底部，未進(jìn)入膠體。如果將電泳儀的電極倒置后，則目標(biāo)蛋白會(huì)進(jìn)入電泳緩沖液。所以可以排除蛋白電荷的因素。是不是明白蛋白沉淀了��？請(qǐng)各位專家給分析下吧，多謝啦！ |
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2樓2014-12-09 17:22:35
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cisong: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 應(yīng)該是你所說(shuō)的那種情況，目標(biāo)蛋白跟細(xì)胞壁連在一起了。謝謝大牛�。�！ 2014-12-14 18:21:03
cisong: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 應(yīng)該是你所說(shuō)的那種情況，目標(biāo)蛋白跟細(xì)胞壁連在一起了。謝謝大牛�。�！ 2014-12-14 18:21:03
| 疏水性大到只能用純水才能洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)也是能跑膠的，跑不進(jìn)去可能是等電點(diǎn)太高，在pH9.0的時(shí)候不帶多少電荷就不動(dòng)了。我也有一個(gè)蛋白質(zhì)在pH8.0幾乎不進(jìn)膠的，正常。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
cisong3樓2014-12-10 01:25:33
4樓2014-12-14 15:19:00
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7樓2014-12-14 18:16:05
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