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[求助]
強疏水性蛋白跑非變性蛋白電泳不易進膠 已有2人參與
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| 目標(biāo)蛋白來源是細(xì)菌，菌體破碎高速離心得到粗提液。在用粗提液做疏水作用色譜時發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白疏水性很強，洗脫時20mM的Tris都不能將明白蛋白洗脫下來，需要用超純水才可以。將疏水作用色譜純化用超純水洗脫下來的包含木蛋白的部分收集，超濾濃縮到1mL左右。由于疏水色譜純化的洗脫液幾乎全是超純水，所以添加20mM Tris（pH9.0），20mM NaCl，5%甘油，1mM PMSF（異丙醇溶解的100mM濃度的母液）。冰上平衡10分鐘后上樣做非變性蛋白電泳。蛋白電泳用37.5:1比例的膠配置，pH9.0。上層膠濃度為4%，下層膠濃度為6%。電泳初始20分鐘電泳為100V，之后電泳為300V，持續(xù)2h。電泳結(jié)束后，根據(jù)目標(biāo)蛋白活性染色，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白停留在上樣槽底部，未進入膠體。如果將電泳儀的電極倒置后，則目標(biāo)蛋白會進入電泳緩沖液。所以可以排除蛋白電荷的因素。是不是明白蛋白沉淀了�。空埜魑粚＜医o分析下吧，多謝啦！ |
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送紅花一朵 
7樓2014-12-14 18:16:05
2樓2014-12-09 17:22:35
冼亮淀粉酶
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【答案】應(yīng)助回帖
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cisong: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 應(yīng)該是你所說的那種情況，目標(biāo)蛋白跟細(xì)胞壁連在一起了。謝謝大牛！�。� 2014-12-14 18:21:03
cisong: 金幣+50, ★★★★★最佳答案, 應(yīng)該是你所說的那種情況，目標(biāo)蛋白跟細(xì)胞壁連在一起了。謝謝大牛！�。� 2014-12-14 18:21:03
| 疏水性大到只能用純水才能洗脫下來的蛋白質(zhì)也是能跑膠的，跑不進去可能是等電點太高，在pH9.0的時候不帶多少電荷就不動了。我也有一個蛋白質(zhì)在pH8.0幾乎不進膠的，正常。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
3樓2014-12-10 01:25:33
4樓2014-12-14 15:19:00
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