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zoe回望專家顧問
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[求助]
為什么SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳跑出來老是一條線，沒有條帶（mark也跑不出來） 已有7人參與
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用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳跑蛋白質(zhì)，不知為什么每次都跑不開，在濃縮膠的時(shí)候明顯還看見樣品間的間隔，但是到了分離膠就跑在一起了，就成了一條藍(lán)色的線（溴酚藍(lán)配液指示），而且跑著跑著藍(lán)色就變黃色了，在機(jī)器上讀出來只有一條亮帶，其他的就什么都沒有了，之前以為是濃度不對，所以分離膠7、5%10%15%都跑過，結(jié)果也是一樣的，樣品濃度也是稀釋前后電泳效果一樣，pH是6、8和8、9，染色的時(shí)候也加了B-巰基乙醇的。染色（用的是考然）脫色之后還是一條線，沒有任何條帶（還有就是我發(fā)現(xiàn)我的膠的顏色脫不下來，還是藍(lán)色的，以為時(shí)間不夠所以有脫過一夜但還是不行）。下面是我的膠體配方，7.5%、10%都跑過。我的蛋白質(zhì)一次都沒跑分開過，電腦上看都是只有一條亮的線，那條線就是上圖中的綠色線（以下圖做說明），前后半月都在跑膠，可能跑了有40多塊，但是都沒有一塊分開的。前天點(diǎn)了mark，mark是新買的，還是沒有跑出來（這個(gè)是不是就證明是我膠的原因？能不能給我個(gè)膠的配方啊，詳細(xì)點(diǎn)的）。因?yàn)檫@個(gè)原因，我實(shí)驗(yàn)一直進(jìn)行不下去，好著急啊，謝謝。這些是咋回事？謝謝解答~~ 這是膠的配方 這是剛剛跑完的樣子 |
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樣品有好幾種處理方法，我把具體的貼出來你看看（這是我申請課題里面的，可能字有點(diǎn)多），不過確實(shí)有TCA這。 1、TCA-丙酮沉淀法 取一定量的土壤，加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液，充分振蕩搖勻后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白，然后4℃，12 000 r /min 離心30min。棄上清液，收集沉淀。加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液，充分振蕩混勻，- 20℃放置1h，清洗沉淀，4℃，12 000 r /min 離心15min。重復(fù)清洗3次。棄上清液，收集沉淀，然后置于-20℃冰箱中，使丙酮完全揮發(fā)。 2、酚-NaOH-醋酸銨-丙酮法 取5g土壤，加入10 mL 0.1mol /L的NaOH溶液，20℃振蕩30min，之后在12000 r/min，20℃下離心10min，取6mL上清液，加入16mL液態(tài)酚和10mL去離水，20℃振蕩60min，10000 r/min，20℃ 下離心10min，吸取15mL酚相，并加入15 mL去離子水，20℃振蕩50min并離心，吸取15mL酚相并加入5倍體積的0.1 mol /L醋酸銨（用甲醇配置），-18℃過夜，后在12000 r/min，4℃下離心10min，獲得的顆粒用0.1 mol /L醋酸銨洗滌，-18℃沉淀15min，之后離心，后用80%丙酮洗滌2次，然后置于-20℃冰箱中至丙酮揮發(fā)完全。 3、差速離心法（間接法） 取20g土壤樣品，放入50ml離心管中，加入20ml冷的PBS緩沖液并放置在冰上，用混合式勻漿器勻漿30s,間隔后再處理30s，在2500g下低速離心5min，上清液收集在新的50ml的離心管。土壤沉淀重新加20ml冷的PBS液，同上操作步驟，合并兩次的提取上清液，在4 ℃、10 000 ×g離心10min。離心后棄去上清，沉淀物中加入250ul冷的PBS ，渦旋后轉(zhuǎn)移至2ml微量離心管中。在第一次的沉淀管中再加入250μL PBS，收集剩余的細(xì)胞殘留物，收集合并2次的溶液。然后在10 000×g下離心10mn，收集沉淀并立即在液氮中冷凍。 4、直接裂解土壤/細(xì)胞提取宏蛋白質(zhì)組學(xué)的方法 取5 g土壤放在50ml玻璃瓶，加入10ml堿性緩沖（5% SDS，50mM的Tris-HCl，pH值8.5；0.15 M NaCl；0.1mM EDTA； 1mM MgCl2；50mM DTT）。渦旋2-3分鐘使其分散，然后沸水浴10min。將所得漿液冷卻5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到50ml Falcon管中，劇烈渦旋混合3min。將渦旋溶液離心（2095×g 10min），將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中。向每個(gè)試管中，加入冷凍100％三氯乙酸（TCA），并使終濃度為25 ％的TCA。顛倒試管幾次，后將試管放置在-10℃條件下過夜。在20 800×g下離心20min，得到濃縮蛋白沉淀，棄去上清液。蛋白質(zhì)沉淀用1ml冷丙酮（ -10℃ ）洗滌，然后離心（20 800 ×g，10min），丙酮洗滌步驟被重復(fù)三次。蛋白質(zhì)沉淀在空氣中干燥，直到所有的丙酮蒸發(fā)。 |
7樓2014-12-05 09:36:11
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