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金蟲 (小有名氣)

應助: 14 (小學生)
金幣: 292.2
散金: 21
帖子: 267
在線: 50.3小時
蟲號: 1185569
注冊: 2011-01-07
性別: GG
專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能

[求助] 關(guān)于GS115酵母轉(zhuǎn)化問題

大家好：
   小弟最近在做酵母表達蛋白實驗。結(jié)果轉(zhuǎn)化后總是沒有克隆長出，很是郁悶。實驗步驟如下，請大神指教。
感受態(tài)的制備：
      1. 挑去單克隆GS115于50 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃過夜。
      2. 取500 ul 菌液加入到500 ML YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h左右，測OD600
      3. 當OD600在1. 3-1.5 時，1500 g 5 min 離心，500 ml 冰滅菌水重懸
      4.  1500 g 5 min 離心，250 ml 冰滅菌水重懸
      5. 1500 g 5 min 離心，20  ml 冰1 M 山梨醇重懸
      6.1500 g 5 min 離心，1  ml 冰1 M 山梨醇重懸（很粘稠）
      7. 100 ul每管分裝，-80 保存。
質(zhì)粒的制備：
      1： BstXI 單酶切20 ug質(zhì)粒，使質(zhì)粒線性化，同時加去磷酸化酶 37℃  4 h
      2.  熱滅活，天根回收試劑盒回收質(zhì)粒DNA。
轉(zhuǎn)化：
   1.  100 ul 感受態(tài)+ 線性化的質(zhì)粒40 ul 轉(zhuǎn)入到0.2 cm預冷的電擊杯中
   2.  1500 V  25 uF  電阻 200 ，電擊
   3.  取電擊液體加入到Y(jié)PDS平板中（含100 ug/mL zeocine），涂布，30℃培養(yǎng)。

結(jié)果五天仍無克隆長出。（另，因為在別的地方做實驗，感受態(tài)從-80度拿出來后放在冰上約4h 后實驗。）

請大神指點迷津。謝謝

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1樓 2014-12-23 14:56:28

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