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畢赤酵母電轉(zhuǎn)化問(wèn)題求助
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我的電轉(zhuǎn)步驟如下，但不知道是否有問(wèn)題，涂到MD板上兩天了，也沒(méi)有長(zhǎng)出來(lái)，請(qǐng)各位大俠幫我看看，謝謝 1. 感受態(tài)的制備：過(guò)夜培養(yǎng)的OD =1.4，取25ml離心---用25ml冰浴滅菌水重懸離心---用12.5ml冰浴滅菌水重懸離心----用2ml冰浴1M山梨醇重懸離心-------用500微升1M山梨醇重懸80微升分裝----負(fù)80備用 2.質(zhì)粒線性化：測(cè)序正確的質(zhì)粒用SacI每期峨眉線性化------DNA直接回收試劑盒回收------用BAP去磷酸化試劑盒去磷酸化-------跑膠回收，用25微升TE洗脫，濃度大約為30ng/ul 3.電轉(zhuǎn)化：用伯樂(lè)的電轉(zhuǎn)移，按照儀器自身的畢赤酵母的電轉(zhuǎn)參數(shù)進(jìn)行，用的0.2的電轉(zhuǎn)杯 4.電轉(zhuǎn)后30℃靜置1-2h，取200ul涂板；還有兩個(gè)是把電轉(zhuǎn)液1500g離心30s棄上清，沉淀混勻涂板 但兩天了都沒(méi)有東西長(zhǎng)出來(lái)，不知道是不是哪兒出問(wèn)題了，請(qǐng)指教 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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475502411: 金幣+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置頂 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 熱情啊 2012-09-17 17:25:15
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1949stone: MolEPI+1, 熱情啊 2012-09-17 17:25:15
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你的感受態(tài)等于是只用山梨醇處理了，這樣效果不好。我在資源帖上分享了畢赤酵母現(xiàn)做現(xiàn)用感受態(tài)和長(zhǎng)期保存感受態(tài)的制備方法。轉(zhuǎn)化效率都非常好。建議你去看看然后試試。 你的菌OD值才1.4，只離心了25mL，菌量太少了，感受態(tài)不要做的菌量太低。 另外，質(zhì)粒線性化后不用去磷酸化，都是線性化產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)畢赤酵母的。 電轉(zhuǎn)后要加500--1000uL的冰預(yù)冷1 M山梨醇后再?gòu)?fù)蘇，如果涂MD板是不用復(fù)蘇的，涂抗性板需要搖床復(fù)蘇1 h后再涂板。 涂板200uL太少了點(diǎn)，本來(lái)菌少轉(zhuǎn)化效率也低，就要多涂。 僅為交流。 |
7樓2012-09-17 16:18:14
小丹木木
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6樓2012-09-17 13:53:42
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reallpf
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個(gè)人覺(jué)得你的步驟沒(méi)有什么變化。由于酵母的細(xì)胞壁是很厚的，感受態(tài)的制備過(guò)程中只有山梨醇處理沒(méi)有什么效果。建議你用http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057長(zhǎng)期感受態(tài)制備方法。另外電轉(zhuǎn)的參數(shù)都是一樣的，任何一篇關(guān)于畢赤酵母學(xué)位論文都有。 |
47550241115樓2012-09-18 21:42:56
2樓2012-09-15 20:44:10
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5樓2012-09-17 09:09:49
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謝謝，我初做看大家是這么說(shuō)的 我請(qǐng)問(wèn)一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI線性化的，但不知道是否有問(wèn)題，涂到MD板上3-4天了，長(zhǎng)得跟針尖一樣很小很小，不用力看都看不見(jiàn)，并且沒(méi)有涂開(kāi)的部分是一片一片的，連單個(gè)小菌落也沒(méi)有，我都懷疑是不是克隆子，但應(yīng)該是酵母，因?yàn)槭墙湍傅奈兜馈?br /> 涂板的時(shí)候取200ul涂板；還有兩個(gè)是把轉(zhuǎn)化后的全部菌1500g離心30s棄上清，沉淀混勻涂板 現(xiàn)在實(shí)在沒(méi)有辦法往下進(jìn)展，因?yàn)槲抑貜?fù)一次還是這樣的，今天我把長(zhǎng)出來(lái)的那些東西用YPD培養(yǎng)基沖洗下來(lái)分別涂了不同濃度的G418的YPD板和空白的YPD板，以及MD板，想看看能不能長(zhǎng)出來(lái) 希望您能給我分析一下，往下怎么做？ 謝謝 |
8樓2012-09-17 17:00:34
reallpf
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9樓2012-09-18 09:22:21
10樓2012-09-18 12:45:15
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