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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 畢赤酵母電轉化問題求助
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[求助]
畢赤酵母電轉化問題求助
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我的電轉步驟如下，但不知道是否有問題，涂到MD板上兩天了，也沒有長出來，請各位大俠幫我看看，謝謝 1. 感受態(tài)的制備：過夜培養(yǎng)的OD =1.4，取25ml離心---用25ml冰浴滅菌水重懸離心---用12.5ml冰浴滅菌水重懸離心----用2ml冰浴1M山梨醇重懸離心-------用500微升1M山梨醇重懸80微升分裝----負80備用 2.質粒線性化：測序正確的質粒用SacI每期峨眉線性化------DNA直接回收試劑盒回收------用BAP去磷酸化試劑盒去磷酸化-------跑膠回收，用25微升TE洗脫，濃度大約為30ng/ul 3.電轉化：用伯樂的電轉移，按照儀器自身的畢赤酵母的電轉參數(shù)進行，用的0.2的電轉杯 4.電轉后30℃靜置1-2h，取200ul涂板；還有兩個是把電轉液1500g離心30s棄上清，沉淀混勻涂板 但兩天了都沒有東西長出來，不知道是不是哪兒出問題了，請指教 |
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 酵母表達純化一站式解決！ | 【分子生物】EPI帖 |
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reallpf
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
475502411: 金幣+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置頂 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 熱情啊 2012-09-17 17:25:15
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你的感受態(tài)等于是只用山梨醇處理了，這樣效果不好。我在資源帖上分享了畢赤酵母現(xiàn)做現(xiàn)用感受態(tài)和長期保存感受態(tài)的制備方法。轉化效率都非常好。建議你去看看然后試試。 你的菌OD值才1.4，只離心了25mL，菌量太少了，感受態(tài)不要做的菌量太低。 另外，質粒線性化后不用去磷酸化，都是線性化產(chǎn)物直接轉畢赤酵母的。 電轉后要加500--1000uL的冰預冷1 M山梨醇后再復蘇，如果涂MD板是不用復蘇的，涂抗性板需要搖床復蘇1 h后再涂板。 涂板200uL太少了點，本來菌少轉化效率也低，就要多涂。 僅為交流。 |
7樓2012-09-17 16:18:14
4755024112樓2012-09-15 20:44:10
3樓2012-09-16 09:52:06
4樓2012-09-16 22:51:59
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