 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3780 | 回復(fù): 26 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||
[求助]
畢赤酵母電轉(zhuǎn)化問題求助
|
||||
|
我的電轉(zhuǎn)步驟如下，但不知道是否有問題，涂到MD板上兩天了，也沒有長出來，請(qǐng)各位大俠幫我看看，謝謝 1. 感受態(tài)的制備：過夜培養(yǎng)的OD =1.4，取25ml離心---用25ml冰浴滅菌水重懸離心---用12.5ml冰浴滅菌水重懸離心----用2ml冰浴1M山梨醇重懸離心-------用500微升1M山梨醇重懸80微升分裝----負(fù)80備用 2.質(zhì)粒線性化：測(cè)序正確的質(zhì)粒用SacI每期峨眉線性化------DNA直接回收試劑盒回收------用BAP去磷酸化試劑盒去磷酸化-------跑膠回收，用25微升TE洗脫，濃度大約為30ng/ul 3.電轉(zhuǎn)化：用伯樂的電轉(zhuǎn)移，按照儀器自身的畢赤酵母的電轉(zhuǎn)參數(shù)進(jìn)行，用的0.2的電轉(zhuǎn)杯 4.電轉(zhuǎn)后30℃靜置1-2h，取200ul涂板；還有兩個(gè)是把電轉(zhuǎn)液1500g離心30s棄上清，沉淀混勻涂板 但兩天了都沒有東西長出來，不知道是不是哪兒出問題了，請(qǐng)指教 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 酵母表達(dá)純化一站式解決！ | 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有293人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 畢赤酵母轉(zhuǎn)化 關(guān)于G418
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求助關(guān)于畢赤酵母電轉(zhuǎn)抗性的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 關(guān)于畢赤酵母電轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 關(guān)于畢赤酵母gs115可否用轉(zhuǎn)化化學(xué)轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求助：畢赤酵母電轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 有人知道畢赤酵母 氯化鋰轉(zhuǎn)化里面鮭魚精 怎么配制的不？
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 畢赤酵母轉(zhuǎn)化表達(dá)
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 畢赤酵母轉(zhuǎn)化問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 求助畢赤酵母電轉(zhuǎn)化問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母表達(dá)
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于畢赤酵母電轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 【求助/交流】求助畢赤酵母電轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于畢赤酵母電轉(zhuǎn)后PCR驗(yàn)證問題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 【求助/交流】畢赤酵母電轉(zhuǎn)化問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教畢赤酵母轉(zhuǎn)化之后的篩選（鑒定）
已經(jīng)有4人回復(fù)
小丹木木
榮譽(yù)版主 (著名寫手)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 26 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.999
- 金幣: 6801.7
- 散金: 1553
- 紅花: 35
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 1489
- 在線: 743.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 1272639
- 注冊(cè): 2011-04-21
- 性別: MM
- 專業(yè): 疫苗學(xué)
- 管轄: 分子生物
6樓2012-09-17 13:53:42
reallpf
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 6
- 應(yīng)助: 150 (高中生)
- 金幣: 3388.3
- 散金: 2
- 紅花: 12
- 帖子: 342
- 在線: 72.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1892494
- 注冊(cè): 2012-07-14
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
475502411: 金幣+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置頂 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 熱情啊 2012-09-17 17:25:15
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
475502411: 金幣+10 2012-09-17 17:02:40
1949stone: 回帖置頂 2012-09-17 17:24:13
1949stone: MolEPI+1, 熱情啊 2012-09-17 17:25:15
|
你的感受態(tài)等于是只用山梨醇處理了，這樣效果不好。我在資源帖上分享了畢赤酵母現(xiàn)做現(xiàn)用感受態(tài)和長期保存感受態(tài)的制備方法。轉(zhuǎn)化效率都非常好。建議你去看看然后試試。 你的菌OD值才1.4，只離心了25mL，菌量太少了，感受態(tài)不要做的菌量太低。 另外，質(zhì)粒線性化后不用去磷酸化，都是線性化產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)畢赤酵母的。 電轉(zhuǎn)后要加500--1000uL的冰預(yù)冷1 M山梨醇后再復(fù)蘇，如果涂MD板是不用復(fù)蘇的，涂抗性板需要搖床復(fù)蘇1 h后再涂板。 涂板200uL太少了點(diǎn)，本來菌少轉(zhuǎn)化效率也低，就要多涂。 僅為交流。 |
7樓2012-09-17 16:18:14
26樓2012-12-09 22:49:55
reallpf
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 6
- 應(yīng)助: 150 (高中生)
- 金幣: 3388.3
- 散金: 2
- 紅花: 12
- 帖子: 342
- 在線: 72.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1892494
- 注冊(cè): 2012-07-14
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
|
個(gè)人覺得你的步驟沒有什么變化。由于酵母的細(xì)胞壁是很厚的，感受態(tài)的制備過程中只有山梨醇處理沒有什么效果。建議你用http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4760057長期感受態(tài)制備方法。另外電轉(zhuǎn)的參數(shù)都是一樣的，任何一篇關(guān)于畢赤酵母學(xué)位論文都有。 |
47550241115樓2012-09-18 21:42:56
2樓2012-09-15 20:44:10
3樓2012-09-16 09:52:06
4樓2012-09-16 22:51:59
5樓2012-09-17 09:09:49
|
謝謝，我初做看大家是這么說的 我請(qǐng)問一下，我用的是GS115，PIC3.5K，SacI線性化的，但不知道是否有問題，涂到MD板上3-4天了，長得跟針尖一樣很小很小，不用力看都看不見，并且沒有涂開的部分是一片一片的，連單個(gè)小菌落也沒有，我都懷疑是不是克隆子，但應(yīng)該是酵母，因?yàn)槭墙湍傅奈兜馈?br /> 涂板的時(shí)候取200ul涂板；還有兩個(gè)是把轉(zhuǎn)化后的全部菌1500g離心30s棄上清，沉淀混勻涂板 現(xiàn)在實(shí)在沒有辦法往下進(jìn)展，因?yàn)槲抑貜?fù)一次還是這樣的，今天我把長出來的那些東西用YPD培養(yǎng)基沖洗下來分別涂了不同濃度的G418的YPD板和空白的YPD板，以及MD板，想看看能不能長出來 希望您能給我分析一下，往下怎么做？ 謝謝 |
8樓2012-09-17 17:00:34
reallpf
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 6
- 應(yīng)助: 150 (高中生)
- 金幣: 3388.3
- 散金: 2
- 紅花: 12
- 帖子: 342
- 在線: 72.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1892494
- 注冊(cè): 2012-07-14
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
9樓2012-09-18 09:22:21
10樓2012-09-18 12:45:15
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 475502411 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070305高分子化學(xué)與物理 304分求調(diào)劑 +7 | c297914 2026-03-28 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 394求調(diào)劑 +3 | 好事多磨靜候佳?/a> 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703本科鄭州大學(xué)求調(diào)劑 +3 | nhj_ 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 好好讀書。 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿南京航空航天大學(xué)材料學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | @taotao 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑一志愿哈工大324 +7 | 閆旭東 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑，各位老師看看我�。�！ +5 | 祁祺祺 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿211院校 344分 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)學(xué)碩，求調(diào)劑 +5 | 丶風(fēng)雪夜歸人丶 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿南師大0703化學(xué) 275求調(diào)劑 +4 | Ripcord上岸 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 305求調(diào)劑 +5 | 哇盧卡庫 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +6 | 田洪有 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 081700 調(diào)劑 267分 +11 | 迷人的哈哈 2026-03-23 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料與化工328分調(diào)劑 +6 | 。，。，。，。i 2026-03-23 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 290分調(diào)劑求助 +3 | 吉祥止止陳 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0854電子信息求調(diào)劑 +7 | α____ 2026-03-22 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 上海電力大學(xué)材料防護(hù)與新材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室招收調(diào)劑研究生（材料、化學(xué)、電化學(xué)，環(huán)境） +4 | 我愛學(xué)電池 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[有機(jī)交流]
 有機(jī)合成求助
 20+3
|
FENGSHUJEI 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿山東大學(xué)藥學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 開開心心沒煩惱 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +4 | LHHL66 2026-03-23 | 4/200 |
|