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[交流]
請教關(guān)于qRT-PCR對照設(shè)置的一些問題
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本人近期準備做qRT-PCR,看了一些相關(guān)資料，但是對于試驗中對照設(shè)置的問題還是有些不太明白， 具體問題為：1.在合成cDNA的過程中，（1）對于陰性對照，有的說是每對引物設(shè)不加模板的對照，還有的說是每個樣品設(shè)不加逆轉(zhuǎn)錄酶的對照，究竟應(yīng)該怎么設(shè)呢？（2）這些對照每次試驗都要設(shè)嗎？（3）還有陽性對照怎么設(shè)，每個樣品用內(nèi)參引物進行反轉(zhuǎn)錄就是陽性對照嗎？ 2.在以cDNA為模板進行定量PCR時，陽性對照和陰性對照又應(yīng)該如何設(shè)置？ 還請了解qRT-PCR的前輩們不吝賜教,不勝感激！ |
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dongrh1981
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-28 17:53:48
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-28 17:53:48
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嚴謹?shù)闹v，每次試驗都要帶一個陽性對照和一個陰性對照，陽性用來測試你配制的PCR體系是否漏加或錯加組分，陰性用來判讀你的真?zhèn)�PCR試驗過程是否存在污染。陰性對照是指不加模板，用于環(huán)境中是否存在PCR擴增產(chǎn)物污染，也可用于觀察設(shè)計的引物是否有二聚體；陽性對照是用來判斷你設(shè)計的引物是否能夠擴增出正確的PCR片段，如果用actin而不是靶標引物做陽性對照的話，actin出來了而樣品沒出來的話，你無法判斷是你的體系少加了組分還是你的引物設(shè)計不合理。上述對照既適用于逆轉(zhuǎn)錄也適用于DNA樣品的PCR擴增。 不知道你試驗的目的，不過做人源RNA的逆轉(zhuǎn)錄一般都用6隨機堿基引物或者oligo dT引物，這樣得到的cDNA能用于任何一個靶標基因的后續(xù)操作。 |
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xiaoyund1
2樓2014-12-26 21:05:15
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5樓2014-12-28 18:23:01
dongrh1981
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-31 10:25:41
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-31 10:25:41
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不用專門針對每個體系做不加逆轉(zhuǎn)錄的對照，只需要在提取時加入DNase消化基因組DNA就行，商品化得試劑盒基本都有這一步，如果是自己DIY的RNA提取試劑的話，那就跑下電泳，看有沒有基因組DNA污染；另外，檢測轉(zhuǎn)錄水平的試驗引物都設(shè)計在跨外顯子區(qū)域，就算有基因組DNA污染也是沒有辦法擴出來的，除非引物設(shè)計不合理或者用的是sybr Green法，如果用sybr Green法的話，建議用商品化試劑盒提RNA，DIY的試劑就買點DNase回來，摸索下用量就行，不加逆轉(zhuǎn)錄酶做對照不能解決基因組DNA污染問題。 RNA存在一定程度講解，但如果提取到的量足夠并能及時放入-80冰箱，應(yīng)該不會講解多少，當(dāng)然，最好是現(xiàn)提現(xiàn)用，并且嚴格控制好RNA質(zhì)量和所設(shè)計好的引物，所以你需要先把提取方案設(shè)計或優(yōu)化好，同時做之前對引物做些評價，后續(xù)試驗就能一氣呵成，不然后面得不到好的數(shù)據(jù)，或者數(shù)據(jù)一團糟分析不出結(jié)論。 |
6樓2014-12-29 00:14:58
阿Q~~
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