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[交流]
請(qǐng)教關(guān)于qRT-PCR對(duì)照設(shè)置的一些問題
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本人近期準(zhǔn)備做qRT-PCR,看了一些相關(guān)資料，但是對(duì)于試驗(yàn)中對(duì)照設(shè)置的問題還是有些不太明白， 具體問題為：1.在合成cDNA的過程中，（1）對(duì)于陰性對(duì)照，有的說是每對(duì)引物設(shè)不加模板的對(duì)照，還有的說是每個(gè)樣品設(shè)不加逆轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照，究竟應(yīng)該怎么設(shè)呢？（2）這些對(duì)照每次試驗(yàn)都要設(shè)嗎？（3）還有陽性對(duì)照怎么設(shè)，每個(gè)樣品用內(nèi)參引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄就是陽性對(duì)照嗎？ 2.在以cDNA為模板進(jìn)行定量PCR時(shí)，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照又應(yīng)該如何設(shè)置？ 還請(qǐng)了解qRT-PCR的前輩們不吝賜教,不勝感激！ |
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阿Q~~
至尊木蟲 (文壇精英)
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7樓2014-12-29 07:59:43
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-28 17:53:48
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-28 17:53:48
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嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹v，每次試驗(yàn)都要帶一個(gè)陽性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照，陽性用來測(cè)試你配制的PCR體系是否漏加或錯(cuò)加組分，陰性用來判讀你的真?zhèn)�PCR試驗(yàn)過程是否存在污染。陰性對(duì)照是指不加模板，用于環(huán)境中是否存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染，也可用于觀察設(shè)計(jì)的引物是否有二聚體；陽性對(duì)照是用來判斷你設(shè)計(jì)的引物是否能夠擴(kuò)增出正確的PCR片段，如果用actin而不是靶標(biāo)引物做陽性對(duì)照的話，actin出來了而樣品沒出來的話，你無法判斷是你的體系少加了組分還是你的引物設(shè)計(jì)不合理。上述對(duì)照既適用于逆轉(zhuǎn)錄也適用于DNA樣品的PCR擴(kuò)增。 不知道你試驗(yàn)的目的，不過做人源RNA的逆轉(zhuǎn)錄一般都用6隨機(jī)堿基引物或者oligo dT引物，這樣得到的cDNA能用于任何一個(gè)靶標(biāo)基因的后續(xù)操作。 |
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2樓2014-12-26 21:05:15
送紅花一朵 |
謝謝你的詳細(xì)解答。 我的實(shí)驗(yàn)是考察原核細(xì)菌中某幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，內(nèi)參為16S rDNA，用的是基因特異性引物。 從總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA時(shí)，你說的是做不加模板的對(duì)照，這樣每條引物做一個(gè)陰性對(duì)照就可以了；而有些人說是做不加反轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照，這樣將其產(chǎn)物為模板做PCR時(shí)就可以判斷是否有基因組DNA的污染，由于用的是基因特異引物，而且我要檢測(cè)好幾個(gè)基因，這樣算下來對(duì)照的數(shù)目就特別多。 唉，好幾天了，方案還沒設(shè)計(jì)好。RNA提了兩次都有降解，惆悵中…… |
4樓2014-12-28 17:51:59
dongrh1981
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-31 10:25:41
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xiaoyund1: 金幣+5 2014-12-31 10:25:41
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不用專門針對(duì)每個(gè)體系做不加逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照，只需要在提取時(shí)加入DNase消化基因組DNA就行，商品化得試劑盒基本都有這一步，如果是自己DIY的RNA提取試劑的話，那就跑下電泳，看有沒有基因組DNA污染；另外，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平的試驗(yàn)引物都設(shè)計(jì)在跨外顯子區(qū)域，就算有基因組DNA污染也是沒有辦法擴(kuò)出來的，除非引物設(shè)計(jì)不合理或者用的是sybr Green法，如果用sybr Green法的話，建議用商品化試劑盒提RNA，DIY的試劑就買點(diǎn)DNase回來，摸索下用量就行，不加逆轉(zhuǎn)錄酶做對(duì)照不能解決基因組DNA污染問題。 RNA存在一定程度講解，但如果提取到的量足夠并能及時(shí)放入-80冰箱，應(yīng)該不會(huì)講解多少，當(dāng)然，最好是現(xiàn)提現(xiàn)用，并且嚴(yán)格控制好RNA質(zhì)量和所設(shè)計(jì)好的引物，所以你需要先把提取方案設(shè)計(jì)或優(yōu)化好，同時(shí)做之前對(duì)引物做些評(píng)價(jià)，后續(xù)試驗(yàn)就能一氣呵成，不然后面得不到好的數(shù)據(jù)，或者數(shù)據(jù)一團(tuán)糟分析不出結(jié)論。 |
6樓2014-12-29 00:14:58
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