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求助PCR擴(kuò)增不出來的問題..... 已有11人參與
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最近做分子實(shí)驗(yàn)PCR，總是做不出來，不知道哪位大俠能夠指點(diǎn)一下.... PCR反應(yīng)總體系為20 ul，其中包含： DNA（10 ng/ul） 3ul ； Primers（2 uM）上下游各3ul； Taq酶（5U/ul） 0.2ul； dNTP（1mM） 4ul ； 10Xbuffer（含Mg2+，1Xbuffer中含2mM） 2ul； ddH2O補(bǔ)齊至20ul。 該體系用做擴(kuò)增葉綠體DNA時(shí)，完全沒問題，但是在擴(kuò)增核基因時(shí)，僅擴(kuò)增出一次，就再也沒擴(kuò)增出來了。從擴(kuò)增效果看，也并不是特別理想。以前做的時(shí)候，是用的公司提供的預(yù)混液mix，只需加入DNA、primers、Taq，拿水補(bǔ)齊就行了，且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。現(xiàn)在用同樣的擴(kuò)增程序，可擴(kuò)增結(jié)果怎么都出不來。試了很多次，更換引物（新合成的引物）、增加引物濃度（終濃度為0.3、0.5、1uM的都試過）、更換dNTP、更換DNA、增加DNA模版濃度（體系中30ng、40ng、50ng的都試過），但最終都是無結(jié)果。PCR擴(kuò)增程序沒問題的，因?yàn)橹坝妙A(yù)混液做出來有結(jié)果的。只是現(xiàn)在沒有條件了，沒有再購買預(yù)混液了。 另外，不知道水是不是有問題？我做葉綠體基因的時(shí)候，擴(kuò)增結(jié)果良好，擴(kuò)增圖譜比較清晰，但用同樣的體系，只是更換引物，沒有更換水，結(jié)果怎么都做不出來了，求大神幫忙..... |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2015-01-23 13:47:21
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2015-01-23 13:47:21
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引物和模板的濃度看起來是高了，但是如果已經(jīng)對(duì)兩者的濃度進(jìn)行過摸索，還是沒有得到結(jié)果的話，就可以考慮擴(kuò)增時(shí)酶的問題（普通的Taq酶或者是熱啟動(dòng)Taq酶）。 如果采用相同的體系，只是針對(duì)不同的DNA模板，其中一個(gè)DNA模板擴(kuò)增完全沒有問題，而另一個(gè)無論怎樣進(jìn)行體系優(yōu)化也沒有結(jié)果，說明問題是在DNA模板本身，是否是降解了，亦或是引物設(shè)計(jì)不合理，無法擴(kuò)增。 |
4樓2015-01-22 11:04:07
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10樓2015-01-25 17:05:01
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