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raymondleung銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助關(guān)于甲基化PCR實(shí)驗(yàn) 已有2人參與
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| 最近一直在做甲基化的PCR，一直沒法獲得擴(kuò)增的條帶，模板用的是qiagen的試劑盒處理后的DNA ，PCR是25ul的體系， 用的寶生物的GC buffer和LA taq酶。反應(yīng)條件95度5min，然后開始循環(huán)，95度30s，退火30s , 72度30s，最后延伸10min，4度保溫，退火從50到65度都試用了，沒見條帶。到底是怎么回事？求大神解答 |
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18761615793
木蟲 (正式寫手)
小蟲
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【答案】應(yīng)助回帖
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raymondleung(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-02-09 22:12:06
raymondleung(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-02-09 22:12:06
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循環(huán)數(shù)正常，但是針對(duì)LA的酶時(shí)間就不一定了，72℃延伸 30s 我覺得時(shí)間少了，我們做的話都是10min，終延伸min的。既然摸索了很多溫度都沒有成功，說(shuō)明溫度沒有問(wèn)題。 LA和熱啟動(dòng)Taq酶或是高保真酶不一樣，針對(duì)大于10kb以上的片段，使用LA擴(kuò)增， 延伸時(shí)間短的話還沒來(lái)得及擴(kuò)增就進(jìn)入下一循環(huán)了 |
4樓2015-02-09 14:04:11
huanglinmi
鐵蟲 (初入文壇)
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2樓2015-02-09 11:12:26
鍵盤上的腳丫
金蟲 (小有名氣)
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3樓2015-02-09 11:53:13
raymondleung
銅蟲 (小有名氣)
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5樓2015-03-12 20:58:04
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